专利名称：人源hiv广谱中和抗体a16及其相关生物材料与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人源HIV特异性的Fab抗体及其相关生物材料与应用，特别涉及人源HIV中和抗体A16及其相关生物材料与应用。
背景技术：
获得性免疫缺陷综合征(Acquiredimmunodeficiency syndrome,AIDS)简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起以T细胞免疫功能缺陷为主的综合征。自1981年发现艾滋病以来，全球已有超过6000万人感染HIV，其中约2500万人已经死亡。据WHO统计，新的感染和死亡人数逐年增加，现在每天就有大约1.6万新发感染。我国于1985年发现首例AIDS病人，迄今累计报告HIV感染者已有43.4万，其中死亡8.8万，但估计我国存活HIV感染者和病人约78万。在云南、河南、新疆等地区，HIV感染已出现流行趋势。令人担忧的是，HIV在我国的传播已从献血、吸毒、卖淫等高危人群转向普通人群，且性传播越来越成为主要途径。因此，大力开展艾滋病防治已成为当务之急。如果措施不力，必将对我国的人口健康和社会发展产生巨大影响。然而，目前既无有效的预防疫苗，也无根治AIDS的药物。位于HIV颗粒表面的包被糖蛋白(Env)介导病毒感染靶细胞的过程(I)。该蛋白(gpl60)由表面亚基gpl20和跨膜亚基gp41通过非共价键连接。在天然状态下，gpl60为三聚体，其中三分子的gpl20形成一个球状复合物，而三分子gp41则象三个脚，插入病毒包膜内。在HIV侵入靶细胞过程中，gpl20主要功能是与受体CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)结合，而gp41分子主要介导病毒和细胞的膜融合。HIV包膜蛋白不但介导病毒感染靶细胞的过程，同时也是诱导中和抗体反应的关键蛋白。艾滋病疫苗失败的一个主要的原因是以往所设计的各种疫苗免疫原都不能诱导有效的HIV中和抗体。深入研究HIV感染免疫应答的分子基础，尤其是中和抗体的抗原表位和中和病毒的分子机制，并据此改造免疫原以诱导中 和抗体，是当前艾滋病疫苗设计的重点策略。同时，中和抗体也是天然的病毒侵入抑制剂， 动物攻毒实验和病人治疗的临床实验皆证实基于中和抗体的被动免疫具有显著的预防和治疗效果(2)。尽管HIV自然感染不能诱导保护性免疫，但一些感染者的血清(多克隆抗体)却具有中和不同亚型的广谱中和活性，说明HIV本身具有保守的中和抗体表位。过去几年对先前分离的几个广谱中和单克隆抗体(bl2，2G12，2F5，4E10)进行了结构解析，证实它们识别包膜蛋白gpl20或gp41上相对保守的抗原结构，主要阻断受体结合和膜融合过程(3-4)。如单克隆抗体IgG-bl2作用于包膜蛋白的gpl20亚基，可以阻断病毒与受体的结合，而4E10和2F5则作用于gp41亚基，主要是通过阻断病毒细胞膜融合过程而发挥中和作用。由于近年艾滋病疫苗研究的不断失败以及现有治疗药物的局限性，国际社会对HIV中和抗体的研究投入极大的热情，近期发现了具有很好病毒中和活性的人源单克隆抗体VRCOl和VRC02 (5)、PG9和PG16 (6)、10E8 (7)、PGT抗体(8)等。广谱高效的HIV中和抗体不但可以指导疫苗设计，而且具有可能的治疗和预防作用，对HIV感染的诊断也具有重要的意义。
HIV具有高度变异性，造成多种亚型(Subtypes)和重组型(CRF)在世界不同地区的流行。多数HIV广谱中和抗体(如bl2、2G12、2F5、4E10、VRC01、VRC02)都是从B亚型感染者分离鉴定，P9和pl6来源于非洲A亚型感染者。然而，目前发现的HIV广谱中和抗体仅是少数，介导血清中和活性的大部分抗原表位有待鉴定(9)。在我国流行着多种HIV亚型，特别是B’亚型(泰国B)、B/C和A/E重组型已成为占90%以上的主要的流行毒株，但令人遗憾的是，尚未见有关从我国HIV感染者分离到广谱中和抗体的报道。参考文献:1.Chan，D.C.，and Kimj P.S.(1998) HIV entry and its inhibition.Cell93，681-684.
2.Gong, R., Chen, W., and Dimitrov, D.S.(2012) Candidate antibody-basedtherapeutics against HIV-1.BioDrugs26，143-162.
3.Chen, W., and Dimitrov, D.S.(2009) Human monoclonal antibodiesand engineered antibody domains as HIV-1entry inhibitors.Curr Opin HIVAIDS4，112-117.
4.Chen, W., and Dimitrov, D.S.(2012)Monoclonal antibody-based candidatetherapeutics against HIV typel.AIDS Res Hum Retroviruses28, 425-434.
5.Wuj X.，Yang, Z.Y.，Li, Y.，Hogerkorpj C.M.，Schiefj W.R.，Seaman, M.S.，Zhou, T.，Schmidt, S.D.，Wuj L.，Xuj L.，Longoj N.S.，McKee, K.，0’ Dell，S.，Louder, M.K.，Wycuffj D.L.，Feng, Y.，Nason, M.，Doria-Rosej N.，Connors, M.，Kwongj P.D.，Roederer，M.，Wyatt，R.T.，Nabel，G.J.，and Mascolaj J.R.(2010) Rational design ofenvelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.Science329，856-861.
6.Walker, L.M.，Phogatj S.K.，Chan-Huij P.Y.，Wagner, D.，Phungj P.，Goss, J.L.，Wrinj T.，Simekj M.D.，Fling，S.，Mitcham，J.L.，Lehrmanj J.K.，Priddy, F.H.，Olsen, 0.A.，Frey, S.M.，Hammond, P.W.，Kaminsky, S.，Zambj T.，Moyle, M.，Koffj W.C., Poignardj P., and Burton, D.R.(2009) Broadand potent neutralizing antibodiesfrom an African donor reveal a new HIV-1vaccine target.Science326，285-289.
7.Huang, J.，Ofekj G.，Laubj L.，Louder, M.K.，Doria-Rosej N.A.，Longoj N.S.，Imamichij H.，Bailer, R.T.，Chakrabartij B.，Sharmaj S.K.，Alamj S.M.，Wang, T.，Yang，Y.，Zhang, B.，Miguelesj S.A.，Wyatt, R.，Haynes, B.F.，Kwongj P.D.，Mascolaj J.R.，andConnors，M.(2012)Broad and potent neutralization of HIV-1by a gp41_specifichuman antibody.Nature491，406-412.
8.Walker, L.M.，Huber, M.，Dooresj K.J.，Falkowskaj E.，Pejchalj R.，Julien，J.P.，Wang, S.K.，Ramos, A.，Chan-Huij P.Y.，Moyle, M.，Mitcham, J.L.，Hammond, P.W.，Olsen, 0.A.，Phungj P.，Fling，S.，Wong, C.H.，Phogatj S.，Wrinj T.，Simekj M.D., Koffj W.C., Wilson, 1.A., Burton, D.R., and Poignardj P.(2011)Broad neutralizationcoverage of HIV by multiple highly potent antibodies.Nature477，466-470.
9.Scheidj J.F.，Mouquetj H.，Feldhahnj N.，Seaman, M.S.，Velinzonj K.，Pietzsch，J.，Ottj R.G.，Anthony, R.M.，Zebroskij H.，Hurley, A.，Phogatj A.，Chakrabartij B.，Li，Y.，Connors, Μ.，Pereyraj F.，Walker, B.D.，Wardemannj Η.，Ho，D.，Wyatt, R.T.，Mascolaj J.R., Ravetchj J.V., and Nussenzweigj M.C.(2009)Broad diversity of neutralizingantibodies isolated from memory B cells in HIV-1nfected individuals.Nature458, 636-640.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人源抗艾滋病病毒(HIV)基因工程抗体及其相关生物材料与应用。本发明所提供的人源抗HIV基因工程抗体是Fab抗体，名称为A16，它由抗体的重链的Fd片段和抗体的轻链组成，所述轻链由可变区' 和恒定区Q组成，所述重链Fd片段由可变区Vh和恒定区亚单位ChI组成，所述V1^P '均由决定簇互补区(Complementarity-Determining Region, CDR)和框架区(Framework Region, FR)组成，所述决定簇互补区由⑶R1、⑶R2和⑶R3组成；其中，所述Vl的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列3的第26-31位所示、如序列3的第49-51位所示，如序列3的第88-98位所示，所述Vh的⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列4的第26-33位所示、如序列4的第51-58位所示，如序列4的第97-115位所示。所述Fab抗体A16中，所述Vh和'的框架区可均来源于人。所述Vh的氨基酸序列具体可如序列表中序列4的第1-124位所示；所述' 的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第1-108位所示。所述Fab抗体A16中，所述Q和所述ChI均可来源于人。所述重链Fd片段的氨基酸序列具体可如序列表中的序列4所示；所述轻链的氨基酸序列具体可如序列表中的序列3所示。其中序列表中的序列3和序列4分别由214个和238个氨基酸残基组成。由上述Fab抗体A16得到的衍生抗体也属于本发明的保护范围。所述衍生抗体具体可为含有所述Fab抗体A16的全分子IgG抗体，将所述Fab抗体A16的Vh和\连接得到的单链抗体。1)-10)中的任一种与A16相关的生物材料也属于本发明的保护范围:I)编码A16的核酸分子；2)含有I)所述核酸分子的表达盒；3)含有I)所述核酸分子的重组载体，或含有2)所述表达盒的重组载体；4)含有I)所述核酸分子的重组微生物、或含有2)所述表达盒的重组微生物、或含有3)所述重组载体的重组微生物；5)含有I)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有3)所述重组载体的转基因细胞系；6)编码所述衍生抗体的核酸分子；7)含有6)所述核酸分子的表达盒；8)含有6)所述核酸分子的重组载体，或含有7)所述表达盒的重组载体；9)含有6)所 述核酸分子的重组微生物、或含有7)所述表达盒的重组微生物、或含有8)所述重组载体的重组微生物；
10)含有6)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有7)所述表达盒的转基因细胞系、或含有8)所述重组载体的转基因细胞系。上述与A16相关的生物材料中，所述转基因细胞系为非动物繁殖材料和非植物繁殖材料。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。上述与A16相关的生物材料中，I)所述核酸分子具体可为编码A16的DNA分子,6)所述核酸分子为编码所述衍生抗体的DNA分子；所述\的CDRl的编码序列具体如序列表中序列I的第76-93位所示，所述' 的⑶R2编码序列具体如序列表中序列I的第145-153位所示，所述\的CDR3的编码序列具体如序列表中序列I的第262-294位所示，所述Vh的CDRl的编码序列具体如序列表中序列2的第76-99位所示，所述Vh的CDR2的编码序列具体如序列表中序列I的第151-174位所示，所述Vh的CDR3的编码序列具体如序列表中序列I的第289-345位所示。上述与A16相关的生物材料中，所述Vh的编码序列具体如序列表中序列2的第1-372位所示；所述' 的编码序列具体如序列表中序列I的第1-324位所示；进一步，所述Fd片段的编码序列具体如序列表中序列2所示，所述Fab抗体的轻链的编码序列具体如序列表中序列I所示。所述重组载体具体可为将上述编码基因插入pComb3XSS的多克隆位点得到的重组载体。下述A1-A6中的任一种用途也属于本发明的保护范围:AUA16在制备诊断HIV感染的试剂、治疗HIV感染的药物或预防HIV感染的疫苗中的应用；
A2、A16在制备诊断艾滋病的试剂、治疗艾滋病的药物或预防艾滋病的疫苗中的应用；A3、所述衍生抗体在制备诊断HIV感染的试剂、治疗HIV感染的药物或预防HIV感染的疫苗中的应用；A4、所述衍生抗体在制备诊断艾滋病的试剂、治疗艾滋病的药物或预防艾滋病的疫苗中的应用；A5、所述生物材料在制备诊断HIV感染的试剂、治疗HIV感染的药物或预防HIV感染的疫苗中的应用；A6、所述生物材料在制备诊断艾滋病的试剂、治疗艾滋病的药物或预防艾滋病的疫苗中的应用。所述HIV 具体可为 HIV A 亚型(如 MG505.WOM.ENV.A2 和 MG505.WOM.ENV.H3)、HIVB亚型(如 SF162、NL4-3、JRFL 和 TRO), HIV C 亚型(如 Dul56.12 和 CAP45.2.00.G3)、HIV B’亚型(如 CNE9 和 CNEll )、HIV A/E 亚型(如 CNE3 和 CNE5)、HIV B/C 亚型(如 CNE20 和 CNE23)。本发明采用噬菌体抗体展示技术，从我国B’型HIV感染者分离HIV包膜蛋白特异性人源单克隆Fab抗体，命名为A16，它具有特殊的序列结构，可以与多种亚型的HIV包膜蛋白结合，对HIV具有很强的中和活性。可利用该抗体的CDR区或Fab或IgG全抗体基因，可在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞及任何表达系统中制备不同形式的基因工程抗体，以用于制备治疗、预防和诊断HIV感染和艾滋病的药物、疫苗以及诊断试剂。
图1为A16与多种HIV包膜蛋白抗原的免疫反应性。图2为A16对HIV毒株SF162和NL4-3的中和活性。图3为A16对gpl20 二硫键的依赖性分析。图4为A16对gpl20与⑶4结合的抑制作用。
具体实施例方式本发明运用噬菌体表面呈现技术，从一个中国B’亚型HIV感染者获得外周血淋巴细胞，通过基因工程技术构建了人源抗HIV基因工程抗体文库，并从中筛选获得特异性抗HIV基因工程Fab抗体A16，获得该抗体基因及其在原核细胞中的表达，表位分析表明该抗体作用于HIV包膜蛋白的受体结合部位，具有对HIV感染的中和活性。A16是一种人源的在原核细胞中获得稳定表达的重组Fab功能性片段，可特异性结合HIV的包膜蛋白，对HIV感染具有中和活性。该Fab抗体作用于病毒包膜蛋白的受体结合区。本发明所提供的人源抗HIV基因工程抗 体是Fab抗体A16，其特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗HIV抗体基因库的特异性筛选获得，相应的三个决定簇互补区域(⑶Rs)⑶R1XDR2和⑶R3为该抗体特有的全新序列。A16抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定簇互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。换言之，其轻链和重链可变区相应的三个⑶R区序列组合及其⑶R之间的框架区(FRs)序列组成了每个抗体可变区特征。A16的 Vh 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列分别为:GFPFSDYN、ISSTSRNI 和 TRDLSSLFFCRQTSCPSAY，轻链的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列分别为:NIRRRT、DDR 和 QVWDSSSDHWV。A16的Fd片段的核苷酸序列如序列表中序列2所示，A16轻链的编码序列如序列表中序列I所示；A16的Fd片段的氨基酸序列如序列表中的序列4所示，轻链的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。根据A16可变区中特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同或接近的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而可以获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造；利用上述获得的A16基因，可在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞及任何表达系统中制备不同形式的基因工程抗体，或以此为基础进行改建而获得含有该抗体基因的其他基因，从而获得类似于A16具有结合并中和HIV的抗体产物。以下的优选实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容。下述实施例中的实验方法，为说明本发明，采用的材料与试剂包括:噬菌体表达载体pComb3XSS、及人源Fab模板载体pComb3XTT和pComb3X λ见由Barbas等人编著的《Phage Display-ALaboratory Manual)) 一书的第 9 章(Carbos F.Barbas III, DennisR.Burton, JamieK.Scott, Gregg J.Siverman.Phage Display-A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press.New York);所用辅助卩遼菌体为 VCSM13 (美国 Stratagene 公司 Cat No:200251-81);菌株为 XLl-Blue (Stratagene 公司 Cat No:200228) ；mRNA 分离试剂盒(Invitrogen公司Part No:45-0019);第一链合成试剂盒(Invitrogen公司SuperScriptTM II First-Strand Synthesis System for RT-PCR Cat No:11904-18) ;PCR扩增试剂 Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen 公司 Cat No:12532);胶回收试剂盒 QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN Cat No:28706);内切酶 Sfi I (Roche公司 Cat No:1288059);T4 连接酶(New England Biolab 公司 Cat No:M0202);胰酶(SigmaCat No:T7409);酶标抗人 Fab 二抗(Sigma Cat No:A0293);酶标抗 HA 二抗(Sigma Cat No:H6533) ;TMB 底物(Sigma Cat No:T0440);核酸酶(Novagen 公司 Cat No:70746-3);镍填料 N1-NTA Superflow (GE 公司 Cat No: 17-5318-02);蛋白 G (GE 公司);HRP 标记抗 M13 抗体(Sino Biological Inc, Cat No: 11973-MM05)。重组 HIV-1 包膜蛋白 gpl20 (来自 Bal、SF162、ADA、JRFL、JRCSF、R2、YU2、MN、LAI 病毒株)或 gpl40 (来自 92RW020 和 C.ZA.1197MB病毒株)、以及可溶性CD4蛋白(sCD4)购自美国Immune Technology公司；NHS-LS_Biotin生物素标记试剂盒(Cat No:24450)购自Thermo Fisher Scientific公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素(Cat No:43-4323)购自Invitrogen公司。用于制备HIV假病毒的HIV骨架质粒pSG3deltaEnv (Cat No:11051)、表达HIV包膜蛋白(Env)的质粒包括A亚型MG505.WOM.ENV.A2(Cat No:11528)和 MG505.WOM.ENV.H3(Cat No:11529)、B 亚型 TRO (CatNo:11023)、C 亚型 Dul56.12 (Cat No:11306WPCAP45.2.00.G3 (Cat No:11316)、以及抗HIV单克隆抗体bl2 (Cat No:2640)和VRCOl (Cat No:12033)均由美国国立卫生研究院NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 提供；表达 B，(CNE9> CNE11)> A/E(CNE3、CNE5)和B/C (CNE20、CNE23)亚型HIV包膜蛋白(Env)的质粒参见Shang H等发表的文献(Shang H, Han X, Shi X, Zuo T, Goldin M, Chen D, Han B, Sun ff, Wu H, Wang X, ZhangL.Genetic and neutralization sensitivity of diverse HIV-1env clones fromchronically infected patients in China.J Biol Chem,2011,286(16):14531-41);表达B亚型SF162和JRFL包膜蛋白(Env)的质粒参见He Y等发表的文献(He Y, Honnenff, Krachmarov C, Kayman S, Corvalon J, Pinter A.Efficient isolation of novel humanmonoclonal antibodies with neutralizing activity against HIV-1from transgenicmice expressing human Ig loc1.J.1mmunol.2002，169:595-605);表达 B 亚型 NL4-3 包膜蛋白(Env)的质粒参见Chong H等发表的文献(Chong H, Yao X, Zhang C，Cai L, CuiS，Wang Y, He Y.Biophysicalproperty and broad ant1-HIV activity of Albuvirtide,a3-maleimimidopropionic acid-modified peptide fusion inhibitor.PLoS One,2012,7 (3): e32599)。在实施 例中作为对照抗体的HY5识别位于gpl20上⑶4结合区的构象表位，在实施例中作为对照抗体的HY7识别位点位于gpl20V3环顶部的线性表位。以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为本领域的常规材料、试剂。实施例1为A16的筛选和制备方法；实施例2为A16的的表达和纯化；实施例3为A16与HIV包膜蛋白抗原的反应性；实施例4为A16对HIV的中和活性的检测；实施例5为确定A16是否作用于gpl20的构象表位；实施例6为确定A16能否抑制gpl20与⑶4的结
入
口 ο实施例1、人源抗HIV抗体的Fab片段的制备一、人源抗HIV抗体的Fab片段的基因序列和氨基酸序列的获得
1、噬菌体抗体库的构建建库技术主要参考Barbas等所介绍的方法(Carbos F.Barbas III, DennisR.Burton, Jamie K.Scott, Gregg J.Siverman.Phage Display-A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press.New York),如抗体基因的引物设计及PCR扩增、卩遼菌体表达载体的制备等。首先进行人源IgG Fab段基因的PCR扩增。其步骤是:采用淋巴细胞分离液从HIV感染者分离外周血单核淋巴细胞(PBMC)，以mRNA分离试剂盒提取总细胞RNA，然后以第一链合成试剂盒的Oligo-dT引物将提取的RNA经逆转录制备成cDNA。用一组第一轮PCR引物以cDNA为模板扩增重链和轻链的可变区基因，PCR条件为:94°C 15秒，560C 15秒，72°C 90秒，30个循环。同时，分别以一套PCR引物以pComb3XTT为模板扩增抗体重链恒定区基因ChI片段和轻链恒定区基因C K片段，以PComb3X λ T为模板扩增轻链恒定区基因C λ片段。上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，以DNA纯化试剂盒QIAquick kit (德国QIAGEN公司)纯化后获得第一轮PCR产物。随后，用第二轮PCR引物分别对重链可变区(VH)和恒定区(ChI )基因、轻链可变区(VL)和恒定区(Ck或Ca )基因进行连接，PCR条件为:94°C 15秒，56°C 15秒72°C 2分钟，20个循环。如此VH和ChI连接后产生重链的Fd片段，连接后产生轻链。第二轮PCR产物经琼脂糖凝胶回收，以DNA纯化试剂盒QIAquick kit (德国QIAGEN公司)纯化。再用第三轮PCR引物对重链和轻链基因进行连接，PCR条件为:94°C 15秒，56°C 15秒72°C 3分钟，20个循环。PCR产物经DNA纯化试剂盒(QIAquick kit)回收后获得1.5Kb左右的Fab基因片段。将Fab片段和载体pComb3XSS均用Sfi I酶切后经QIAquick kit回收。将Fab酶切回收产物和载体pComb3XSS酶切回收的3.3Kb片段通过T4连接 酶进行连接，得到连接产物pComb3XSS-Fab。连接产物经乙醇沉淀后用15 μ I蒸馏水重悬，电转导入300 μ I的大肠杆菌XLl-Blue感受态中(电转条件:Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5Κ伏电压)。电转后用5ml SOC培养基37°C 250rpm转摇I小时，加入IOml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基并于37°C 250rpm转摇2小时，加入183ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基和2ml滴度为1012pfu/ml的辅助噬菌体VCSM13，于37°C 300rpm转摇2小时后加入卡那霉素至70μ g/ml，置37°C 300rpm转摇过夜。次日，于3000g离心15分钟后上清用4%PEG8000和3%NaCl沉淀，经15000g4°C离心15分钟后用2ml含1%BSA的TBS缓冲液(pH7.4)重悬沉淀，全速离心5分钟，上清过滤分装保存-80°C冰箱中。2、噬菌体抗体库的特异性富集用于噬菌体抗体库的特异性富集和筛选的抗原为真核表达的重组HIV包膜蛋白包外区gpl40，来自A亚型HIV-1病毒株92RW020 (简称为A_gpl40)和C亚型HIV-1病毒株 C.ZA.1197MB(简称为 C_gpl40)。用 50 μ 10.1M NaHCO3(ρΗ8.6)溶液包被 A_gpl40 或B-gpl40蛋白于酶标板微孔中，每孔0.5 μ g，于4°C过夜；次日，用150μ 13%BSA37°C封闭I小时，弃封闭液，每孔加入50 μ I新鲜噬菌体抗体库，37°C孵育2小时，弃去未结合噬菌体，用0.5%TBST冲洗5次(第二次10次、第三、四次各15次)，每次冲洗用移液器吹打10-20次，吸净液体后每孔加入50 μ 110mg/ml胰酶TBS溶液，37°C孵育30分钟，将洗脱的噬菌体加入2ml新鲜制备的大肠杆菌XLl-Blue菌液(0D_=1)中，室温孵育15分钟，加入6ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基，于37°C 250rpm转摇2小时，加入91ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基和Iml滴度为1012pfu/ml的辅助噬菌体VCSM13，再于37°C 300rpm转摇2小时后加入卡那霉素至终浓度70 μ g/ml, 37°C 300rpm转摇过夜。于3000g离心15分钟后，上清用4%PEG8000和3%NaCl沉淀，经15000g于4°C离心15分钟后用2ml含1%BSA的TBS (P H7.4)重悬沉淀，全速离心5分钟，上清过滤保存，取50 μ I加入已包被A_gpl40或C_gpl40蛋白的酶标板中，如此反复富集4次。为获得具有交叉反应性的Fab抗体，第一轮和第二轮采用A-gpl40富集，第三轮和第四轮采用C-gpl40富集。3、HIV特异性Fab抗体的小量诱导表达和检测将4次富集的噬菌体稀释106、IO7, IO8倍后各取I μ I加入50 μ I新鲜制备的大肠杆菌XLl-Blue菌液，室温感染15分钟，涂氨苄抗性LB板。第二天选择合适菌落密度的板挑取单克隆菌落，每个单克隆菌落加入到2ml含氨苄青霉素的SB培养基中，于37°C 300rpm转摇6小时，每管中取0.2 μ I菌液在氨苄抗性LB板上保菌，然后各加入8 μ 10.5Μ IPTG，37°C 300rpm转摇过夜。次日离心取上清进行ELISA检测。具体步骤是，将A_gpl40 Wlyg/ml 浓度用 100 μ 10.1M NaHCO3(ρΗ8.6)溶液包被，4°C过夜。第二天用 200 μ 13%BSA37°C封闭I小时，弃封闭液，用0.05%PBS-T洗一遍，加入100 μ I过夜诱导的细菌上清，37°C孵育I小时，0.05%PBS-T洗三遍。加入100 μ I酶标抗人Fab 二抗(1:30000稀释)，37 °C孵育I小时，以0.05%PBS-T洗三遍。用TMB显色30分钟，2M H2SO4终止，酶标仪检测吸光度A值。4、人源Fab抗体A16的核酸序列和氨基酸序列分析从保菌板上挑取阳性克隆相应的菌落，用QIAGEN Miniprep Kit质粒提取试剂盒提取质粒DNA进行核苷酸序列测序。测序为自动测序，轻链测序引物为5’-AAGACAGCTATCGCG ATTGCAG-3，重链测序引物为 5 ’-ACCTATTGCCTACGGCAGCCG-3 ’。将获得的序列进行分析，并与Internet网络上基因库中的IgG序列比对，证实A16为人源特异性Fab抗体，具有特有的轻链和重链基因可变区序列。A16的Fd片段的编码序列如序列表中序列2所示，A16的轻链的编码序列如序列表中序列I所示；其中序列表中序列2的第1-372位为Vh的编码序列；序列表中序列I的第 1-324 位为 \ 的编码序列。采用 IMGT/V-QUEST 软件(http://www.1mgt.0rg)分析 Q)R序列，' 的CDRl的编码序列如序列表中序列I的第76-93位所示，' 的CDR2编码序列如序列表中序列I的第145-153位所示，' 的⑶R3的编码序列如序列表中序列I的第262-294位所示；VH的CDRl的编码序列如序列表中序列I的第76-99位所示，Vh的CDR2的编码序列如序列表中序列I的第151-174位所示，Vh的CDR3的编码序列如序列表中序列I的第289-345位所示。A16的Fd片段的氨基酸序列如序列表中的序列4所示；Fd片段的Vh的氨基酸序列如序列表中序列4的第1-124位所示八的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第1-108位所示。Vl中含有3个决定簇互补区CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如序列表中序列3的第26-31位、49-51位和88-98位所示；被这3个决定簇互补区间隔的其余四个区为框架区。Vh中含有3个决定簇互补区CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如序列表中序列4的第26-33位、51-58位和97-115位所示；被这3个决定簇互补区间隔的其余四个区为框架区。实施例2、人源Fab抗体A16的的表达和纯化将上述筛选获得的含有A16编码基因的重组载体pComb3XSS-Fab转化至大肠杆菌T0P10F’感受态细胞，挑取单个菌落加入到500ml含20mM MgCl2和50 μ g/ml氨苄青霉素的SB 培养基中 37°C 250rpm 摇 5-8 小时(OD6tltl=I )，加入 Iml0.5M IPTG，37°C 250rpm 摇 16 小时，细菌-80°C冻融破菌，加入25 μ I多粘菌素B溶液，0.5 μ I核酸酶冰上摇匀I小时，10000转速离心30分钟,上清用镍填料N1-NTA Superflow N柱或蛋白G柱纯化(依说明书提供的方法进行)。得到纯化的抗HIV抗体人源Fab抗体Α16。实施例3、Α16与HIV包膜蛋白的反应性以ELISA法检测Α16与11种来自不同亚型HIV的包膜蛋白重组抗原(gpl20或gpl40)的交叉反应性，包括HIV亚型A，B和C。其步骤为，将每个蛋白以I μ g/ml浓度用100 μ 10.1M NaHCO3 (ρΗ8.6)溶液分别包被，4°C过夜。第二天用 200ml3%BSA37°C封闭 I 小时，弃封闭液，0.05%PBS-T洗一遍，加入100 μ I小量诱导的细菌上清，37°C孵育I小时后，用0.05%PBS-T洗三遍。加入100 μ I以1:30000稀释的酶标抗人Fab 二抗，37°C孵育I小时，0.05%PBS-T洗三遍。用TMB显色30分钟，2M H2SO4终止，酶标仪检测吸光度A值。结果发现，A16可以与来自不同HIV亚型的包膜蛋白重组抗原反应。如图1所示，A16可以与来自 92RW020 (A)、Bal (B)、SF162 (B)、ADA (B)、JRFL (B)、JRCSF (B)、YU2 (B)、R2 (B)、MN (B)、LAI (B)和C.ZA.1197MB(C)病毒株的重组包膜蛋白反应。如前所述，A亚型92RW020蛋白和C亚型C.ZA.1197MB蛋白为gpl40，其余为B亚型的gpl20蛋白。图1中，从左至右的11个柱状图为来自相应毒株的包膜蛋白重组抗原，第12个柱状图为将BSA (牛血清白蛋白)也以I μ g/ml浓度用100 μ 10.1M NaHCO3 (ρΗ8.6)溶液包被的结果。实施例4、Α16对HIV的中和活性采用HIV假病毒感染系统评价Α16的抗病毒活性，实验方法参见发明人发表的论文(Chong H, Yao X, Zhang C，Cai L, Cui S，Wang Y, He Y.(2012) Biophysical property andbroad ant1-HIV activity of Albuvirtide, a3-maleimimidopropionic acid-modifiedpeptide fusion inhibitor.PLoS One.7(3):e32599;Yao X,Chong H,ZhangC, Waltersperger S, Wang M, Cui S, He Y.(2012)Broad antiviral activity and crystalstructure of HIV-1fusion inhibitor Sifuvirtide.J Biol Chem.287 (9):6788-6796))。具体步骤为将表达HIV毒株(如表I)包膜蛋白(Env)的质粒和HIV骨架质粒pSG3deltaEnv，按质量比1:2的比例转染293T细胞，同时设pSG3deltaEnv对照，即只转染相同量的pSG3deltaEnv。于37°C、5%C02细胞培养箱中孵育6hr以后使质粒进入细胞，而后换液，于细胞培养箱中继续孵育48hr，假病毒分泌至上清中。用移液器尽量多地吸出细胞培养瓶或细胞培养板中的上清，经0.45 μ m滤器过滤或IOOOg离心IOmin取上清，向其中加入FBS使其终浓度为20%，转移入聚丙烯管中于一 80°C保存备用或直接进行病毒滴定。收获大量的假病毒后，加入牛血清终浓度达20%，分装冻存。取出假病毒在96孔板中做5倍稀释，8个梯度，4个复孔，终体积为100 μ I。其中用pSG3deltaEnv单独转染所收上清做相同稀释。将TZM-bl细胞胰酶消化，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至IO5个/ml，每孔加100 μ 1，每孔细胞为IO4个，加入DEAE-dextran，终浓度为15 μ g/ml。将96孔板放入细胞培养箱中，370C，5%C02培养48小时。之后从细胞培养箱中取出96孔板，从上样孔中吸弃上清，加入30 μ I细胞裂解液,放置IOmin后加入100 μ I荧光素酶检测试剂。用移液器从每孔中吸出100 μ I液体，加于对应96孔白板中，于微孔板光度计读取发光值。以pSG3deltaEnv对照孔化学发光值的3倍作为cutoff值,结果用S/C0值表示。用Reed-Muench法计算假病毒的病毒滴度。为检测A16的中和病毒活性 ，将人源抗HIV抗体的Fab抗体A16按倍比稀释铺入96孔板中，终体积为50 μ I，其中用50 μ I DMEM培养基替代药物作为阴性对照。力口入TZM-bI细胞100 μ I (IO5个细胞/ml)含DEAE_dextran终浓度为15 μ g/ml，加入已获得的HIV-1假病毒50 μ 1，每孔相当于IOOTCID5q。培养48h后，利用荧光素酶检测试剂(Promega)测定每孔的相对荧光单位(RLU)。半数中和剂量是能引起50%最大效应(量反应)的剂量，用半数中和剂量(ND5tl)表示。结果如图2和表I所示，A16对表I所列的A、B、B’、C、A/E和B/C亚型HIV假病毒株均具有很强的中和活性，表明A16抗体是一个具有广谱作用的中和抗体。表1.A16对不同亚型HIV的广谱中和活性
权利要求
1.Fab抗体，它由抗体的重链的Fd片段和抗体的轻链组成，所述轻链由可变区\和恒定区Q组成，所述重链Fd片段由可变区Vh和恒定区亚单位ChI组成，所述Vh和\均由决定簇互补区和框架区组成，所述决定簇互补区由⑶R1、⑶R2和⑶R3组成；其特征在于:所述\的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列3的第26-31位所示、如序列3的第49-51位所示，如序列3的第88-98位所示，所述Vh的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列4的第26-33位所示、如序列4的第51-58位所示，如序列3的第97-115位所示。
2.根据权利要求1所述Fab抗体，其特征在于:所述Vh和\的框架区均来源于人。
3.根据权利要求1或2所述Fab抗体，其特征在于:所述Vh的氨基酸序列如序列表中序列4的第1-124位所示；所述\的氨基酸序列如序列表中序列3的第1-108位所示。
4.根据权利要求1或2或3所述抗体的Fab抗体，其特征在于:所述Q和所述ChI均来源于人。
5.根据权利要求1至4中任一所述抗体的Fab抗体，其特征在于:所述抗体重链的Fd片段的氨基酸序列如序列表中的序列4所示；所述轻链的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
6.权利要求1至5中任一所述Fab抗体的衍生抗体,是下述a)或b): a)由权利要求1至5中任一所述Fab抗体的Vh和\连接得到的单链抗体； b)含有权利要求1至5中任一所述Fab抗体的IgG。
7.与权利要求1至5中任一所述Fab抗体相关的生物材料，所述生物材料为1)-10)中的任一种: 1)编码权利要求1至5中任一所述Fab抗体的核酸分子； 2)含有I)所述核酸分子的表达盒； 3)含有I)所述核酸分子的重组载体，或含有2)所述表达盒的重组载体； 4)含有I)所述核酸分子的重组微生物、或含有2)所述表达盒的重组微生物、或含有3)所述重组载体的重组微生物； 5)含有I)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有3)所述重组载体的转基因细胞系； 6)编码权利要求6所述衍生抗体的核酸分子； 7)含有6)所述核酸分子的表达盒； 8)含有6)所述核酸分子的重组载体，或含有7)所述表达盒的重组载体； 9)含有6)所述核酸分子的重组微生物、或含有7)所述表达盒的重组微生物、或含有8)所述重组载体的重组微生物； 10)含有6)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有7)所述表达盒的转基因细胞系、或含有8)所述重组载体的转基因细胞系。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于:1)所述核酸分子为编码权利要求1至5中任一所述Fab抗体的DNA分子，6)所述核酸分子为编码权利要求6所述衍生抗体的DNA分子； 所述\的CDRl的编码序列如序列表中序列I的第76-93位所示，所述\的CDR2编码序列如序列表中序列I的第 145-153位所示，所述' 的CDR3的编码序列如序列表中序列I的第262-294位所示，所述Vh的CDRl的编码序列如序列表中序列2的第76-99位所示，所述Vh的⑶R2的编码序列如序列表中序列I的第151-174位所示，所述Vh的⑶R3的编码序列如序列表中序列I的第289-345位所示。
9.根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于:所述Vh的编码序列如序列表中序列2的第1-372位所示；所述\的编码序列如序列表中序列I的第1-324位所示； 进一步，所述Fd片段的编码序列如序列表中序列2所示，所述Fab抗体的轻链的编码序列如序列表中序列I所示。
10.下述A1-A6中的任一种用途: Al、权利要求1至5中任一所述Fab抗体在制备诊断HIV感染的试剂、治疗HIV感染的药物或预防HIV感染的疫苗中的应用； A2、权利要求1至5中任一所述Fab抗体在制备诊断艾滋病的试剂、治疗艾滋病的药物或预防艾滋病的疫苗中的应用； A3、权利要求6所述衍生抗体在制备诊断HIV感染的试剂、治疗HIV感染的药物或预防HIV感染的疫苗中的应用； A4、权利要求6所述衍生抗体在制备诊断艾滋病的试剂、治疗艾滋病的药物或预防艾滋病的疫苗中的应用； A5、权利要求7-9中任一所述的生物材料在制备诊断HIV感染的试剂、治疗HIV感染的药物或预防HIV感染的疫苗中的应用； A6、权利要求7-9中任一所述的生物材料在制备诊断艾滋病的试剂、治疗艾滋病的药物或预防艾滋病的疫苗中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人源HIV广谱中和抗体A16及其相关生物材料与应用。A16由抗体的重链的Fd片段和抗体的轻链组成，所述重链Fd片段由可变区VH和恒定区亚单位CH1组成，所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成，所述决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列3的第26-31位、第49-51位、第88-98位所示，所述VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列4的第26-33位、第51-58位、第97-115位所示。A16可用于制备治疗、预防和诊断HIV感染和艾滋病的药物、疫苗以及诊断试剂。
文档编号G01N33/571GK103224559SQ20131015442
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者何玉先, 满来, 孟佳子 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所