用于Bt Cry1类毒素广谱检测的抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生化领域，特别是一种用于化化yl类毒素广谱检测的抗体及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[000引 自1987年化Ider等首次报道研制成功转苏云金芽抱杆菌fAyrin知easis，Bt)毒素基因抗虫植物W来，目前已有超过400个化毒素基因被克隆和测 序，能用作商业制剂或转化化y家族基因作物已有十几类(包括化ylAa，化ylAb，化ylAc， CrylB,CrylC，CrylD，CrylE，CrylF，Cry2Aa，Cry2Ab，Cry3A，Cry3B，Cry34,Cry35 等），转 Bt毒素基因抗虫性作物不断出现并得到大面积的推广，产生了极其显著的经济、社会和生 态效益，但随着转化基因抗虫植物的大规模推广，其对生态安全风险W及对人类和其它哺 乳动物的安全隐患逐渐受到关注。目前，我国稻米中已多次被报道发现了化化y毒素基因 和毒素产物，并且已经对我国稻米出口产生了严重不良影响，随着转基因技术的大力发展， 被应用的化化y毒素基因种类愈来愈多，带来的政府安全监管和食品加工企业原料管控 的技术制约愈来愈明显，尤其是当针对一些转基因食物中基因检测不能取得满意效果的时 候，对毒素表达产物安全筛查检测尤为迫切。
[0003]目前针对转基因产品中毒素蛋白的检测方法主要采用针对单一毒素的抗体检测 技术，由于针对不同毒素需要制备相对应的抗体，且抗体制备过程冗长、成本高，不能满足 广谱筛查检测的要求。因此，如何利用化化y毒素具有的相似=维构象特点，开发基于共 性结构的化化y毒素广谱筛选免疫检测技术是一项很有应用价值的工作。
[0004] 根据文献报道大约90%的单克隆抗体针对具有共性结构的抗原都存在一定的交 叉反应，而针对某一种化毒素检测的单、多克隆抗体或单链抗体对于其它同源性较高的毒 素也具有一定的交叉反应，运是基于不同的化y毒素虽然氨基酸序列上有较大差异，但其 =维结构却非常相似的原理，目前，针对化化yl类毒素检测用广谱抗体尚未见相关报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明通过小鼠免疫，获得针对化化yl类毒素检测用广谱抗体， 本发明是运样实现的： 一种用于化化yl类毒素广谱检测的抗体，其特征在于，所述抗体是由保藏号为CCTCC NO:C2015145的杂交瘤细胞分泌产生的。
[0006] 一株保藏号为CCTCCN0:C2015145的杂交瘤细胞，其分泌的抗体用于化化yl类 毒素广谱检测。
[0007] 进一步，本发明所述杂交瘤细胞是运样获得的： 1) 利用MBS法合成免疫原，即将等摩尔数的经过脱盐处理的KLH-N肥与氨基酸序列为 SEQIDNO. 2的多肤混合，4°C反应化，然后置于PBS溶液中透析72h，获得免疫原； 2) 将浓度为Img/ml的免疫原和弗式完全佐剂按体积比1:1比例混合，WlOOug/只的 剂量免疫小鼠；w后每隔两周加强免疫一次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全 佐剂与免疫原混合，第四次免疫结束后一周采血测效价，效价达到血清稀释10000倍，〇〇45。 值大于1. 0时，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；然后采用间接ELISA法筛选细胞培 养上清，选择阳性克隆杂交瘤细胞孔进行亚克隆，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，即获 得所述杂交瘤细胞。
[000引本发明所述抗体在化化yl类毒素广谱检测中的应用。
[0009] 进一步，本发明所述应用，具体为： A) 将保藏号为CCTCCN0:C2015145的杂交瘤细胞接种于小鼠体内，W体内诱生法制备 腹水，然后利用辛酸-硫酸锭法纯化腹水，获得浓度为25mg/ml的抗体，然后WPBS溶液将 抗体稀释1000-16000倍； B) 将抗体包被于固相载体，4。C过夜；次日PBST洗板，加入3%的MPBS，200yL/孔， 37 °C解育化；PBST洗板，加入待检测品，100yL/孔，解育比；加入酶标抗体解育比；PBST 洗板，加底物TMB-过氧化氨脈，100yL/孔，37 °C解育15min后每孔加入50yL浓度为 2mol/LH2SO4,结束反应；同时WPBS溶液作为阴性对照； C) 测定反应液0〇45。值，若待检测品与阴性对照的0D45。比值大于2. 1，则待检测品种含 有化化yl类毒素。
[0010] 本发明根据CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylB，CrylC和CrylF的氨基酸序列，从一 级序列相似性分析、二级抗原性和亲水性分析W及=维结构分析，设计的抗原多肤SEQID NO. 2,将其与载体蛋白KLH进行偶联后，免疫Ba化/c小鼠，成功获得了可分泌针对化化yl 类毒素检测用广谱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株保藏号为CCTCCN0:C2015145; 实验表明，浓度为25mg/ml的该抗体稀释16000倍后，对六种化化yl类毒素的OD45。值与 阴性孔（PBS溶液）的比值均远大于2. 1，可见其效价较高，且对化化yl类毒素具备广谱性 检测效果，弥补化化yl类毒素广谱检测领域的空白。
【附图说明】
[0011] 图1为选定肤段的氨基酸序列对比结果示意图； 图2为选定肤段的抗原性和亲水性分析结果示意图； 图3为六种毒素的=维结构模型进行重叠的结果示意图； 图4为选定肤段的=维结构示意图； 图5为单克隆抗体化ISA检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0012] 实施例中设及溶液的制备方法： (1) 饱和硫酸锭溶液： 在500mL蒸馈水中加入500g硫酸锭，加热至完全溶解；室溫过夜，析出结晶任其留在瓶 中，临用前取所需的量，用化0H调抑至7.8; (2) 醋酸缓冲液（0.06mol/L PH4.8): NaAc0. 29g，HAc0. 141血溶于去离子水，定容至100血，调抑值至4. 8。
[0013] (3)憐酸盐缓冲液（PBS，pH7. 4): 化Cl8.Og，KCl0. 2g，胞2册04 ? 12&0 2. 9g，KH2PO40. 2g，加蒸馈水定容至IL; (4) 洗涂液（PBST):含有 0. 05%Tween的PBS; (5) 封闭液（MPBS):含有3%脱脂奶粉的PBS; (6)巧樣酸盐缓冲液（CPBS，底物缓冲液，P册.5): Ce&Os(巧樣酸）21g，胞2册〇4 ? 12&0 71. 6g，加蒸馈水定容至1L; (7) 底物：10mg/mL的TMB和 25uL0. 65%&〇2溶于 9. 875血CPBS中，现配现用； (8) 四甲基联苯胺（TMB)母液： 称取lOmg四甲基联苯胺溶于1血二甲基亚讽，4°C保存； (9) 终止液（2MH2SO4): 取11. 8血98%的浓硫酸（18M)溶于80血蒸馈水，冷却后定容到100血； (10) 碳酸盐缓冲液（CBS): 胞2〇)3 1. 59g;Na肥〇3 2. 93g，定容到 1L; 实施例中所设及试剂： 弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂均购于Sigma公司； 化ylAa和化ylB抗体购自上海佑隆生物科技有限公司； 实施例中所设及的氨基酸序列： 沈QIDNO. 1:SFREWEADPTNPALREEMRI; 沈QIDNO. 2 :CSFREWEADPTNPALREEMRI。
[0014]实施例1审I恪单克隆抗体 (1) 在GenBank数据库中检索到CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylB，CrylC和CrylF的氨 基酸序列； (2) 利用DNAMAN软件将CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylB，CrylC和CrylF的氨基酸序列 进行对比，找出相似性最高的若干多肤序列，选定肤段的氨基酸序列对比结果如图1所示； (3) 利用DNAStar软件找出C巧lAa，C巧lAb，C巧lAc，CrylB，C巧1C和CrylF中抗原性 和亲水性较强的部分，肤段的抗原性和亲水性分析结果如图2所示； (4) 最后利用SWISS-M孤化网站构建CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylB，CrylC和CrylF 六种毒素的=维结构模型，用Swiss-P化Viewer4. 1. 0软件对=维结构模型进行分析，找 出六种毒素=维结构重叠的区域，六种毒素的=维结构模型进行重叠的结果如图3所示； (5) 将一级序列相似性分析结果、二级抗原性和亲水性分析结果W及=维结构分析结 果进行综合比较，选择序列相似性较高、抗原性和亲水性较强、空间构象相似的一个多肤片 段为最有可能产生广谱性免疫效果的抗原多肤，做为免疫半抗原，该肤段=维结构如图4 所示，图4中，A即为选定肤段，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示；将该序列交由南京金斯 瑞生物科技有限公司合成，为了与载体蛋白KLH偶联，在肤链的一端添加切S残基，合成肤 段序列如SEQIDNO. 2所示； (6) 免疫原制备，W血蓝蛋白（KLH)为载体蛋白，采用MBS法合成免疫原，具体步骤如 下：称取5mgKLH-NHz溶于1ml0.ImM的PBS中，然后加入终浓度为ImM的Sulf〇-MB，4°C 下反应化；再过G25Se地adex凝胶过滤层析柱进行脱盐去除多余的交联剂； 接着将脱盐处理后的KLH-N&和等摩尔数的多肤SEQIDNO. 2混合，于4°C反应化后， 然后在4°C溫度下，置于PBS溶液中透析72h，透析期间每隔9-1化换液一次，即获得免疫 原，然后分装，于-20°C冻存备用； (7)单克隆抗体的制备：利用步骤（6)获得的免疫原免疫8周龄左右Ba化/c雌性小鼠 4只，首次免疫时，将浓度为Img/ml的免疫原和弗式完全佐剂按体积比1:1比例混合后，W 腹腔注射的方式免疫小鼠，免疫剂量为lOOug/只； W后每隔两周加强免疫一次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂与免 疫原混合，第四次免疫结束后一周采血测效价，效价达到理想值（即：血清稀释10000倍且 〇〇45。值大于1.0)时，再按照常规杂交瘤融合技术(参见吴建祥等，"稻攝病菌单克隆抗体的 研制及其对附着胞形成的影晌"微生物学报，2000, 40化）：638-645)与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0进行细胞融合，采用间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择阳性克隆杂交瘤细胞进行 亚克隆，并用有限稀释法连续克隆2-3次，得到一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。
[0015] 间接ELISA法步骤如下： ① 包被：用包被液CBS将包被