专利名称：：一种联合检测hiv-1+2抗体和p24抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种联合检测HIV-l+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术：
：艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmureDeficiencySyndrome,AIDS),是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的，目前尚不能治愈、病死率高的慢性进行性疾病。联合国艾滋病规划署和世界卫生组织联合发布报告指出，2006年全球艾滋病病毒携带者人数为3950万；2006年新增艾滋病感染者430万；2006年全球有290万人死于艾滋病。据中国卫生部《中国艾滋病防治联合评估报告(2007年)》，到2007年底，我国现存艾滋病病毒感染者和病人约70万(55万85万)人，全人群感染率为0.05%(0.04%—0.07%)。其中艾滋病病人8.5万(8万9万)人；2007年新发艾滋病病毒感染者5万(4万6万)人，因艾滋病死亡2万(1.5万2.5万)人。以上数据表明，艾滋病IH以前所未有的程度威胁着人类的安宁、社会的发展与稳定，我国目前已经进入艾滋病快速感染期，若不及时控制，将出现灾难性的后果。但是到目前为止，医学界尚无一种有效的治疗艾滋病的方法，因此在艾滋病的控制方面，早期诊断及时发现感染者并控制其进一步传播就成为艾滋病防治工作的重中之重。根据艾滋病临床表现的不同，可将其分为急性感染期、潜伏期、艾滋病前期、典型艾滋病期四个时期。急性感染期的AIDS通常仅表现为发热、皮疹、淋巴结肿大、乏力、出汗、恶心、呕吐、腹泻、咽炎等轻微症状，绝大多数患者在HIVl/2感染26周后，血清中可出现HIV抗体，可作为早期诊断和疾病筛查的重要指标。急性期症状持续314天后，AIDS出现一个长短不等的(平均210年)的无症状潜伏期，HtV病毒持续繁殖，具有强烈的破坏作用，患者却无任何临床症状。进行广泛的筛查，特别是把好输血关，可大大降低AIDS传播的几率。潜伏期之后，疾病继续发展即进入艾滋病前期和典型艾滋病期，感染者由于免疫功能缺陷导致各种感染，病程发展的后期，感染者出现各种机会性感染和恶性肿瘤，发生严重后果和极高的死亡率。目前的AIDS病原学诊断技术主要包括病毒特异性抗体酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、免疫层析法(胶体金或乳胶颗粒法)、免疫印迹法(WB)、细胞培养法、PCR法，这些方法都有各自的特点和使用对象。ELISA法是目前临床血液筛查中普遍使用检测技术，第三代试剂用于测定病毒抗体，90年代末出现第四代试剂，在检测抗体的基础上同时检测P24抗原，但是ELISA试验操作程序复杂，容易出现假阳性或假阴性结果，且灵敏度低，CLIA与ELISA方法类似，只是灵敏度提高了一些，并没有根本解决ELISA存在的问题，并且二者都存在操作繁琐，反应时间长的问题，而且都需要酶标仪或发光仪和洗板机以及温箱等复杂设备，而且不能单人份检测，进一步限制了他们在一些基层医院、诊所的应用。近几年国内外出现了以胶体金或乳胶颗粒为代表的快速检测试纸条，但是由于结果是肉眼目视观察，容易受观察者主观判断的影响，灵敏度低，结果准确度也不高，而且还不能用P24抗原的检测，检测窗口期较长。免疫印迹法(WB)是目前临床艾滋检测的确认方法，结果准确可靠，但是其技术难度大，目前全世界也只有屈指可数的几家公司可以生产，高昂的使用成本使得它目前仅用于可疑标本的确认，而很少用于筛选。细胞培养法和PCR方法，都需要很高的试验工作环境和条件(无菌操作间，超净工作台)和大量的仪器设备(培养箱，离心机，PCR仪等)，并且操作极其复杂，需要受过严格专业训练的人员操作，，且试验周期很长，不适合用于临床检测用。磁性免疫层析(MgneticImmunoChromatographicTest,MICT)是近年来出现的的一种新一代单人份快速定量检测技术。是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提供对生物样品的定量检测数据。通过检测测量磁场强度来表达标记在样品区域的量，采用标记的免疫复合物-磁场强度的标准曲线，从而达到定量的目的。该技术与传统技术相比具有下述优势1)分析灵敏度比各类目测快速诊断法灵敏10-IOO倍；2)分析速度可在15秒内测量到多达6个分析位点的数据；3)线形范围在1-104的浓度范围内呈线性；4)所用磁性检测仪器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；5)超顺磁性纳米微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变；独立的快速诊断色谱卡(MARCassette)可直接插入MAR检测仪，为目前许多快速临床诊断试剂的整合提供了广泛的开发空间；而且还避免了操作过程中人员或仪器可能发生的交叉污染，提高了分析和过程的安全性。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等)简便快速，单人份操作的优点，又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量的缺点，代表了当今即时检验(PointofCareTest,P0CT)技术发展的方向和潮流，一经问世，发展迅速，目前已经成为替代传统免疫层析技术的首选。目前常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs)，没有外加磁场的情况下不具有任何磁性，只有在外加磁场作用下才会表现出磁性，商品化超顺磁颗粒都经过表面修饰，大大方便了标记过程，标记简便，重复性好。生物素-亲和素系统(BAS)是一种广泛应用的技术，将亲和素包被固相，将生物素标记抗原或抗体，利用生物素亲和素之间极高的亲和力以及一个亲和素结合四个生物素的特性，可以极大的提高反应的灵敏度，经过几十年的发展，目前亲和素和生物素都出现了大量衍生物，可以根据不同的需要选用，标记方法也很简便，大大增加了他们的易用性。将生物素亲和素系统引入磁性免疫层析中，在极大地提高了检测方法的灵敏度的同时，又提供了一种极好的通用技术平台，在规模化生产中减少了标记步骤，增加了工艺的通用性，减少了可变因素。
发明内容本发明的目的即是将磁性免疫层析技术与生物素亲和素系统联合应用在HIV免疫分析中。将链亲和素共价偶联于超顺磁颗粒上，将生物素化HIV1+2抗原和生物素化P24抗体与之混合之后作为检测流动相，将HIV1+2抗原和P24抗体分别包被于硝酸纤维素膜上制成抗体检测线和抗原检测线作为捕获固相，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，在实现高灵敏度检测的同时又能大大縮短检测的窗口期，可以避免前述几种检测方法的不足，又综合了前述几种方法的优势可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以即时给出定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。为达到上述的目的，本发明的技术方案如下本发明的检测HIV-l+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条是将包被膜、结合了HIV-1+2抗原及P24抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜而制成，其中所述的包被膜上预包被有HIVl+2抗原的HIV-1+2抗体检测线和P24抗体的HIVP24抗原检测线，以及生物素化牛血清白蛋白的质控线。选用的底板为透明塑料底板，包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜，选用的吸水垫为纤维素膜，磁颗粒垫为玻璃纤维垫，样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。所述的样品垫处理液是含有1%-5%酪蛋白(casein)和0.1%_1%的聚乙烯醇(PVP)，以及0.01-0.2%吐温-20(Tween-20)的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤A、抗原的处理选用商品化HIV-1+2重组抗原(CTK公司HIVfusionantigengpl20-41-36，cat:A3641);对20mM，pH7.0-7.6的PBS4'C透析过夜;B、抗体的处理选用商品化高效价P24配对单抗(天健公司，cat:210-1011,210-1012);20raM，pH7.0-7.6的PBS4。C透析过夜；C、磁颗粒的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将链亲和素标记到磁颗粒上，选用预活化生物素进行HIV-l+2抗原/P24抗体的标记，将标记好的生物素化抗原/抗体以1:2-1:10的比例(体积比)与链亲和素化磁颗粒混合，确保链亲和素化磁颗粒过量；D、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25u1/cm-50y1/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；E、包被膜的制备使用包被缓冲液分别将HIV-l+2包被抗原和P24包被抗体以及生物素化BSA稀释到0.5-2呢/m的浓度，使用定量喷液装置分别将三者以0.5_1.Ocm的间隔于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35'C烘干8小时，加入干燥剂封存备用；F、样品垫的处理将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35°C烘干8小时；G、试纸条的组装在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。所述的歩骤C包括以下三歩1)链亲和素化磁颗粒的制备使用含有0.l%Tween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mrao1，室温反应1小时，使用含有0.l%Tween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液充分洗涤磁颗粒后加入链亲和素使链亲和素与磁颗粒的分子比例为5:1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5%BSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1%PVP，l%Casein，0.5%Tween-20，5%蔗糖的50mMpH8.2-9.0的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4'C保存备用；2)生物素化HIV-1+2抗原和P24抗体的制备将HIV-1+2抗原和P24抗体对0.02M，pH7.0-7.6的PBS4'C透析过夜，调整浓度为2mg/ml，将预活化生物素使用二甲基亚砜(DMSO)溶解，终浓度为50mM，以20:1的分子比例向抗原或抗体溶液中加入所需量的生物素溶液，室温反应l小时，对0.02MPBS4'C透析过夜，加入等体积甘油后-2(TC保存备用；3)生物素化抗原/抗体与链亲和素化磁颗粒的混合，以0.5ul/mg磁颗粒的量向链亲和素化磁颗粒溶液中加入生物素化HIV-1+2抗原，以0.25ii1/mg磁颗粒的量加入生物素化P24抗体，充分混匀后使用保存缓冲液以l:5-1:20的比例(体积比)将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。所述的步骤D中，磁颗粒的喷涂方法是将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置以50ul/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。所述的步骤E中，包被膜的制备方法是用包被缓冲液(0.02MPB，pH7.0-7.6)将HIV-1+2抗原和P24抗体稀释为0.5mg/ml，生物素化BSA稀释为lmg/ral，使用定量喷膜装置以1u1/cm的量将三者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35。C烘干8小时，加入干燥剂封存备用。与现有快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点1)通过对试纸条的改进，首次将HIV1+2抗体和P24抗体联合引入试纸条中，实现了抗原抗体联检，縮短了HIV检测的窗口期，并且可以大致判断出感染者的感染阶段，为进一步的诊疗提供依据。2)通过在磁颗粒上引入生物素-亲和素系统，使得试纸条的制备过程大大简化，适合大规模生产。3)运用磁性检测仪来进行结果的判读，依据检测线与质控线的磁性检测值比值来进行阴阳性判断，降低了主观性，结果准确、可靠。本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也己经上市，因此能广泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等小批量或单人份使用的单位使用。对于HIV的初筛定性诊断有着积极的意义。图1为本发明联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条结构示意图。为进一步说明本发明联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。具体实施方式本发明所述的联合检测血液中HIV-l+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条，如图1所示，该试纸条是在底板l)上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜2)、结合了HIV-l+2抗原及P24抗体的磁颗粒垫3)、样品垫4)、吸水垫5)，并在上层覆盖透明塑料密封膜6)组装而成的试纸条，包被膜2)上预包被有HIV-l+2抗体检测线Tl及HIVP24抗原检测线T2和质控线C。在具体实施例中，所采用MV1+2抗原对为商品化抗原，HIVP24抗体对为商品化单抗。利用双抗原夹心检测HIV抗体和双抗体夹心检测P24抗原的原理检测标本，当待测标本中含有HIVP24抗原时，抗原会先和磁颗粒上结合的抗体结合，随着层析作用的进行，结合物向前移动到达P24抗体包被线T2处，抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在T2处，同理，标本中含有HIVl+2抗体时，也会在HIVl+2抗原包被线Tl处形成双抗原夹心复合物聚集。另外，未结合生物素化抗体或抗原的链亲和素标记磁颗粒会继续前行到达质控线C时，生物素化BSA会与链亲和素标记磁颗粒结合从而在C线处同样出现磁颗粒聚集。整个反应在30分钟内进行完全，一般反应十五分钟后即可使用磁性免疫层析仪器读卡，Tl线，T2线以及C线都会产生相应的磁性信号值，计算T1/C和/或T2/C的比值，根据预设的界限比值即可判定结果的阴阳性。整个读卡、计算、与预设界限值比对的过程已经完全程序化，磁性检测仪会直接给出阴阳性结果。本发明所述的联合检测血液中HIV-l+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下实例实施例1联合检测血液中HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条及试纸盒的制备方法本实施例的试纸条及试纸盒的制备方法包括以下步骤A、抗原和抗体的制备选用商品化的HIV1+2重组抗原和P24单抗，对20mM，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，4。C透析过夜备用。包被缓冲液的配制0.02MpH7.2的磷酸缓冲液(PBS)为包被缓冲液，0.22ym微孔滤膜过滤除菌后置4'C保存备用，有效期两周。封闭液的配制含0.5%BSA的0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均适用)的磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22ym微孔滤膜过滤除菌后置于4"C保存备用，有效期一周。包被膜的制备用包被缓冲液(0.02MPH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PB)将HIV-l+2抗原和P24抗体稀释为0.5mg/ml，生物素化BSA稀释为lmg/ml，使用定量喷膜装置以1u1/cm的量将三者以0.6cm的间隔均匀喷印于3.5cm宽度硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液(含有0.5%BSA的0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，)中浸泡10分钟后于25-35'C烘干8小时，加入干燥剂封存备用。C、磁颗粒的制备醋酸钠缓冲液的配制用双蒸水和醋酸钠及冰醋酸配制pH值为4.7(pH4.5-5.0均适用)，浓度为50mM的醋酸缓冲液，加入Tween-20至终浓度为0.1%，0.22um微孔滤膜过滤除菌后4'C保存备用，有效期两周。硼酸保存缓冲液的配制用双蒸水，硼酸和硼砂配制pH为8.5(pH8.2-9.0均适用)，终浓度为50mM的硼酸缓冲液，加入PVP，Casine，Tween-20，蔗糖，终浓度分别为1%，1%，0.5%，5%,0.22ym微孔滤膜过滤除菌后4"C保存备用，有效期一周。链亲和素化磁颗粒的制备使用含有0.l%Tween-20的50mMpH4.7(pH4.5-5.0均适用)醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入链亲和素使链亲和素与磁颗粒的分子比例为5:l(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5腿SA的0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1%PVP，l%Casein，0.5%Tween-20，5%蔗糖的50mmolpH8.5(pH8.2-9.0均适用)的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4。C保存备用。生物素化HIV-1+2抗原和P24抗体的制备将HIV-1+2抗原和P24抗体对0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS4'C透析过夜，调整浓度为2mg/rta，将预活化生物素使用匿S0溶解，终浓度为50mM，以20:1的分子比例向抗原或抗体溶液中加入所需量的生物素溶液，室温反应1小时，对0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS4。C透析过夜，加入等体积甘油后-2(TC保存备用。生物素化抗原/抗体与链亲和素化磁颗粒的混合以0.5y1/mg的量向链亲和素化磁颗粒溶液中加入生物素化HIV-l+2抗原，以0.25w1/mg磁颗粒的比例加入生物素化P24抗体，充分混匀后使用保存缓冲液以1:5比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。D、磁颗粒的喷涂与冻干使用BioDot喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒以50ii1/cm的量均匀喷涂于0.8cm宽度玻璃纤维垫上，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用，E、样品垫的处理将1.8cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35'C烘干8小时。样品垫处理液是含有l%_5%Casein和0.1%-1%的PVA以及0.01-0.2%Tween_20的0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS溶液。F、试纸条的组装及切割下述所有操作都必须在湿度小于20%，温度20-25。C的房间内进行。试纸板的组装使用BioDotLM5000型组装仪按照要求将3.5cm宽的包被膜，2.5cm宽的吸水纸，0.8cm宽的磁颗粒垫，1.8cm宽的样品垫组装于9.8cm宽度透明塑料底板上，贴上上层透明塑料盖板，组装成试纸板。试纸条的裁切使用BioDotCM4000型切条机将组装好的试纸板切成0.5cm宽的成品试纸条。G、试纸卡的组装将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底卡上的卡槽内，盖上上盖，使用压卡机将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备用。H、确定该批次的二维码信息品名HIV1+2&P24磁性检测卡批次试纸卡的组装日期，格式为年/月/日，XXXX/XX/XX阴阳性判读标准的确定取100份确认HIVl+2抗体阳性标本(强弱均有)、50份确认HIVP24抗原阳性标本(强弱均有)，500份随机标本使用该批次试纸卡检测，使用磁性检测仪检测结果，计算每个检测卡的T1/C值，T2/C值，使用统计学方法计算均值和标准差，确定T1/C<0.1且T2/C〈0.05为阴性。T1/C〉0.2,或T2/C〉0.1为阳性，二者之间为灰区。I、二维码的打印粘贴将上述二维码信息输入二维码打印机内并打印，将二维码粘贴于试纸卡的特定位置，使用二维码粘贴位置检测器随机抽检2%确保二维码粘贴无误。J、成品包装将贴好二维码的单人份试纸卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内，100人份为一个包装置于一个包装盒内，一盒一份说明书和1瓶10ml装层析缓冲液，即制成试纸盒，该试纸盒于室温避光保存，保质期为18个月。层析缓冲液配方为l%Tween-20，0.5%TritonX-100，1%NP-40，0.05%NaN3，20mmolpH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，。实施例2除了；链亲和素化磁颗粒的制备的歩骤中链亲和素使链亲和素与磁颗粒的比例为1:2。其它步骤同实施例1，实施例3除了链亲和素化磁颗粒的制备的歩骤中链亲和素使链亲和素与磁颗粒的比例为1:10。其它步骤同实施例1。实施例4除了生物素化抗原/抗体与链亲和素化磁颗粒的混合歩骤中充分混匀后使用保存缓冲液以l:IO的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例l。实施例5除了生物素化抗原/抗体与链亲和素化磁颗粒的混合步骤中充分混匀后使用保存缓冲液以l:20的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例l。实施例6本发明的检测卡的使用方法.1、加样从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔带包装，将试纸卡置于平整桌面上，用微量移液器取50pl样本血清加入卡上的加样孔内，再加入50nl层析缓冲液，等待反应进行15分钟。2、测量及结果输出将MICT检测仪预先开机，将检测卡插入检测仪的插卡口，运行仪器，仪器会自动读取卡上的二维码信息并进行测量，即时打印测量结果，阴阳性结果会在打印结果中显示。实施例7本发明的检测卡检测临床标本检测及检测结果表l:正常人标本检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表2:HIV-l+2抗体阳性标本检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>P:阳性；N:阴性表5:临床检测结果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>本发明的试纸卡与进口HIV1+2胶体金试剂进行了对比试验，结果在特异性和灵敏度方面均远远好于胶体金试剂，尤其对于p24抗原阳性标本，本发明的试纸卡显示了胶体金试纸无法比拟的优势，提高了剪除率并縮短了检出窗口期，为早期感染HIV的检测提供了良好的方法。权利要求1、一种联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条，其特征在于该试纸条是将包被膜、结合了HIV-1+2抗原及P24抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的包被膜上预包被有HIV-1+2抗体检测线及HIVP24抗原检测线和质控线。2、根据权利要求1所述的联合检测1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条，其特征在于所述的样品垫是经过样品垫处理液预处理的纤维素膜，所述的样品垫处理液是含有1%-5%酪蛋白和0.1%_1%的聚乙烯醇，以及0.01_0.2%吐温-20的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液。3、根据权利要求1所述的联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤A、抗原的制备选用基因工程技术制备的商品化HIV-l+2重组配对抗原，对20mM，PH7.0-7.6的PBS4'C透析过夜;B、抗体的制备选用商品化的高效价P24配对单抗，对20mMpH7.0-7.6的PBS4'C透析过夜；C、磁颗粒的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺和琥珀酰亚胺共价偶联的方式将链亲和素标记到磁颗粒上，选用预活化生物素进行HIV-1+2抗原/P24抗体的标记，将标记好的生物素化抗原/抗体以1:2-1:IO的比例(体积比)与链亲和素化磁颗粒混合，确保链亲和素化磁颗粒过量；D、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25y1/cni-50u1/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；E、包被膜的制备使用0.02mM,pH7.0-7.6的PBS，分别将HIV-l+2包被抗原和P24包被抗体以及生物素化牛血清白蛋白稀释到0.5-2mg/ml的浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0.5-1.Ocm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35'C烘干8小时，加入干燥剂封存备用；F、样品垫的处理将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35°C烘干8小时；G、试纸条的组装在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜得到试纸板，根据要求的宽度切割即得到试纸条。4、根据权利要求3所述的联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述的步骤C包括以下三步1)链亲和素化磁颗粒的制备使用含有0.l订ween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入碳二亚胺和琥珀酰亚胺使二者终浓度均为20mmol/L,室温反应1小时，使用含有0.l%Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液充分洗涤磁颗粒后加入链亲和素使链亲和素与磁颗粒的分子比例为5:1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5%BSA的0.02M,pH7.0-7.6的PBS室温封闭30分钟，使用含有0.l%Tween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，然后使用含有1%PVP，l%casein，0.5%Tween-20，5%蔗糖的50mM,pH8.2-9.0的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4'C保存备用；2)生物素化HIV-1+2抗原和P24抗体的制备将HIV-l+2抗原和P24抗体对0.02M,pH7.0-7.6的PBS4'C透析过夜，调整浓度为2mg/ml，将预活化生物素使用二甲基亚砜溶解，终浓度为50mM，以20:1的分子比例向抗原或抗体溶液中加入所需量的生物素溶液，室温反应1小时，对0.02M，pH7.0-7.6的PBS4。C透析过夜，加入等体积甘油后-2(TC保存备用；3)生物素化抗原/抗体与链亲和素化磁颗粒的混合，以0.5ul/mg磁颗粒的量向链亲和素化磁颗粒溶液中加入生物素化HIV-1+2抗原，以0.25u1/mg磁颗粒的量加入生物素化P24抗体，充分混匀后使用保存缓冲液以1:5-1:20的比例(体积比)将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。5、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤D中，磁颗粒的喷涂方法是将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置以50"1/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。6、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤E中，包被膜的制备方法是用包被缓冲液将HIV-1+2抗原和P24抗体稀释为0.5mg/ml，生物素化BSA稀释为lmg/ml，使用定量喷膜装置以lul/cra的量将三者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35"C烘干8小时，加入干燥剂封存备用。全文摘要本发明涉及一种联合检测血液中HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是将包被膜、结合了HIV-1+2抗原及P24抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错2mm地粘贴在底板上、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的。包被膜上预包被有HIV-1+2抗体检测线及HIVP24抗原检测线和质控线，本发明将磁性免疫层析技术和生物素亲和素系统引入到HIV-1+2抗体和P24抗原联合检测中，大大提高了检测灵敏度和结果准确度，缩短了检测窗口期，降低了操作人员的劳动强度。文档编号G01N33/558GK101566631SQ20081010482公开日2009年10月28日申请日期2008年4月24日优先权日2008年4月24日发明者于尚永,唐宝军,姚洪涛,宋胜利,应希堂,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司