专利名称：用于同时检测hiv-1、hiv-2、htlv-ⅰ和htlv-ⅱ抗体的免疫检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于同时检测生物学样品中抗以下病毒的抗体的免疫检测药盒HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ。本发明也涉及制造这类免疫检测药盒的方法。
Ⅰ亚型人T-细胞白血病病毒(HTLV-Ⅰ)是与成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATL)密切相关的一种逆病毒(Poieszetal，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77，7415-7419)，它也与被称作为热带痉挛性下肢轻瘫和HTLV-Ⅰ相关性骨髓病(HAM)的神经疾病相关联(Gessainetal.，1985，Lancetii，407-410).Ⅱ亚型人T-细胞白血病病毒(HTLV-Ⅱ)首先是从患有T-细胞毛细胞白血病的患者体内分离(Kalyanaramanetal.，1982，Science218，571-573)。该病毒与毛细胞白血病的T-细胞变种有关。
成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATL)主要发生于日本西南部、加勒比海流域以及中美和南美的部分地区。在这些地区，整个人群的血清阳性者为5%-15%，而在较大年龄组则达到30%。在美国，HTLV-Ⅰ/Ⅱ感染主要是在静脉使用毒品者中。在最近的一份美国红十字会报告中(Williamsetal.，1988，Science，240，643-646)，八个美国城市的39，898名随机献血者中就有10个能检测到抗HTLV-Ⅰ抗体;它所对应的血清流行率为0.025%。在对埃及北方3158人所进行的类似研究中鉴定出两名携带者(流行率为0.06%)(El-Farrashetal，1988，Microbiol.Immunol.，32，981-984).在这两项研究中并未清楚地区分HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ感染。
获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)、与艾滋病相关的综合症(ARC)以及前艾滋病也被认为是由逆病毒，具体是人免疫缺陷病毒(HIV)引起的。最早的艾滋病相关病毒HIV-1(也被称为HTLV-Ⅲ、LAV-1和ARV)已被充分鉴定。另一类称为HIV-2(原来称为LAV-2)的病原性人逆病毒现已从患有艾滋病的西非患者身上分离出来(如见WO87/04459)。最近已证实HIV-2与HIV-1和猿免疫缺陷病毒(SIV)共有大量的保守序列。
HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ在形态及遗传结构上均不同于人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2。其结果是，抗HIV抗原的抗体不应与HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗原有交叉反应。但是，取自艾滋病患者的血清样品都显示出与HTLV抗原有一定程度的交叉反应性(Essexetal.，1983，Science，220，859-862).。
现有技术中已有几个用于单独检测抗HTLV抗原或抗HIV抗原之抗体的诊断检测法的实例。例如，Saxinger等(1984，Science，225，1473-1476)就曾提到在酶免疫检测法(EIA)中利用HTLV-Ⅰ抗原作为免疫吸附剂以检测HTLV-Ⅰ抗体。另一个例子为Gnann等人(1987，J.Virol，61，2639-41)提到的可用于检测HIV-1抗体的肽序列。
最近，已有人试图提供可同时检测抗HTLV和HIV抗原之抗体的诊断药盒。例如，加拿大专利1，245，982和欧洲专利申请136，798提到了用于同时检测HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ和HTLV-Ⅲ(HIV-1)抗体的检测药盒。在这些药盒中，HTLV抗原衍生于得自各种转化细胞系的HTLV病毒颗粒。另外，PCT专利申请WO90/08162涉及利用得自HTLV-Ⅰ的包膜蛋白和合成的HIV肽的抗原同时检测HTLV-Ⅰ、HIV-1和HIV-2抗体的检测药盒。
但是，所有以上检测法均没有提供一种同时检测HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ、HIV-1和HIV-2抗体的灵敏方法。事实上，即使对HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的独立检测法分别加以考虑，所有以上检测法也都不能提供一种完全可以接受的诊断试验。
现有技术中的这些检测法均存在各自的不足之处。在某些情况下，试验所利用的是全病毒或细菌产生的免疫吸附剂。使用这类制剂的不足是缺乏特异性-即假阳性-因为许多未感染的个体的血液中通常含有常发现于制剂中的污染物抗体。与HIV或HTLV不相关并可能存在于这类制剂中其它病毒所共有的抗原决定簇也能导致假阳性的发生。这类现有检测法所存在的另一个问题是敏感性差。缺乏敏感性将使得被污染了的血液逃脱检测，从而有可能感染血液产品接受者并使得未被诊断出的HIV或HTLV携带者的感染性得以继续保留。这类现有结合检测法之所以缺乏敏感性据信是由于当使用全病毒或细菌产生的制品时抗原决定簇在固相上的表面密度较低所引起的。由于这些和其它原因，迫切需要有一种同时检测HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的检测法。它能够更好地确保被感染的血液产品不会进入血库，且可使被感染的个体得到迅速和及时治疗。
本发明的检测药盒通过提供一种敏感、特异的检测工具以及同时检测体液样品中抗HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的方法而解决了上述问题。
本发明的检测药盒包括包被在固相载体上的可用于同时检测抗HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ、HIV-1和HIV-2抗体的肽。
本发明还提供了用于同时检测抗HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ、HIV-1和HIV-2抗体的检测药盒的制造和使用方法。
本发明的检测药盒包括至少四种不同的HIV和HTLV肽，两种为HIV，两种为HTLV。至少一种HIV肽能够识别抗HIV-1抗体，且至少一种其它HIV肽能够识别抗HIV-2抗体。同样，至少一种HTLV肽能够识别抗HTLV-Ⅰ抗体，至少一种其它HTLV肽能够识别抗HTLV-Ⅱ抗体。
现已令人惊奇地发现，当首先将HTLV-Ⅰ和Ⅱ肽且最好是其混合物加到固相载体上，然后再将HIV肽分别或最好是混合加入时，所获得的检测敏感性将得到极大改善。因此，本发明的另一个目的是提供一种可用于同时检测抗HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的检测药盒的制备方法，其中首先是将HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ肽(尤其是其混合物)加至载体上，然后再将HIV-1和HIV-2肽(同样优选其混合物)加至载体上。
本发明的药盒可用于筛选各种生物样品和体液，其中包括血液、血浆、血清、唾液、尿液、眼泪、乳汁或脑脊髓液。
可用于本发明药盒和方法中的HIV-1肽系选自式a-X-b的肽，其中X选自以下各组及其类似物Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr ThrAla Val Pro Trp Asn Ala Ser(BCH-87c)Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr ThrAla Val Pro Trp Asn Ala Ser(BCH-87ck)Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys ArgArg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg(BCH-132)Lys Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys ThrThr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser(BCH-266)Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr ThrAla Val Pro Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile(BCH-408)
Lys Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys ThrThr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile(BCH-408k)a是氨基末端，1-8个氨基酸，但较好是1-5个且更好是1-3个氨基酸，或能有效促进肽偶联或改进肽免疫原性或抗原性的取代基;
b为羧基末端，1-8个氨基酸，优选为1-5个氨基酸，更优选为1-3个氨基酸，或能有效促进肽偶联或改进肽免疫原性或抗原活性的取代基。
用于本发明药盒及方法中的HIV-2肽选自式a-Y-b的肽，其中Y选自下列的一组序列及其类似物;a和b的定义同前。
Arg Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser(BCH-202c)Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser(BCH-202ck)Lys Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala
Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys HisThr Thr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser(BCH-265)
Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser Ala Phe Arg Gln Val(BCH-417)Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser Gly Lys His Ile(BCH-422)用于本发明药盒及方法中的HTLV-Ⅰ肽系选自一组式a-Z-b的肽，其中Z选自Pro His Ser Asn Leu Asp His Ile Leu Glu Pro Ser Ile ProTrp Lys Ser Lys Pro Tyr Val Glu Pro Thr Ala Pro Gln ValLeu(BCH-234)Ala Ile Val Ser Ser Pro Ser His Asn Ser Leu Ile Leu ProPro Phe Ser Leu Ser Pro Val Pro Thr Leu Gly Ser Arg(BCH-416)及其类似物;且a和b的定义同前。
用于本发明药盒及方法中的HTLV-Ⅱ肽系选自一组式a-W-b的肽，其中W选自
Leu Val His Asp Ser Asp Leu Glu His Val Leu Thr Pro SerThr Ser Trp Thr Thr Lys Ile Leu(BCH-219)Thr Ser Glu Pro Thr Gln Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro LeuLeu Val His Asp Ser Asp Leu Glu His Val Leu(BCH-456)Thr Ser Glu Pro Thr Gln Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro LeuVal His Asp Ser Asp Leu Glu His Val Leu(BCH-486)及其类似物;且a和b的定义同前。
选自每组-HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ-的至少一种肽均被用于本发明的检测药盒及方法中。
本发明提供了至少包括四种肽的免疫检测药盒，其中每一种肽分别含有识别和选择性结合HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的抗原决定簇。
如上所定义的，这四组单独的肽分别具有通式a-X-b、a-Y-b、a-Z-b和a-W-b。最好是在本发明的药盒和方法中使用每组肽中的一种。但是，本发明并不限于此。例如，也可使用至少一组肽中的一个以上的肽或每组肽中的数个肽。唯一要求的是a-X-b、a-Y-b、a-Z-b和a-W-b四组肽中的每一组中有至少一种肽被使用。
这里所用的术语“类似物”系指在所述肽链的一个或多个位点上的氨基酸插入、缺失、取代和修饰。
对本发明肽的氨基酸序列的修饰和取代最好是保守的(即对肽的次级结构和亲水性质影响很小)。这些取代包括由DayhoffteAtlasofProteinSegucnceandStructure5，1978以及由ArgosteEMBOJ.8，779-785，1989中所述的取代。例如，属于下列各组之一的氨基酸均代表保守性改变ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;cys、ser、tyr、thr;Val、ile、leu、met、ala、phe;lys、arg、his、及phe、tyr、trp、his。同样，甲硫氨酸(一种易于被氧化的氨基酸)可被正亮氨酸取代。优选的取代也包括用D-异构体取代相应的L-氨基酸。
本说明书中所用的术语“氨基酸”(如a和b的定义中所述的氨基酸)包括所有天然氨基酸、D-构型氨基酸以及非天然的、合成的和被修饰的氨基酸，如高半胱氨酸、乌氨酸、正亮氨酸和β-缬氨酸。
如上所简要叙述的，为了使所选择的肽更适用于作为免疫诊断试剂或作为疫苗的活性成分而修饰本发明的肽常常是有用的，且肯定是在本发明的范围之内。例如，这类改变包括-为了促进肽与合适载体的偶联而利用异双官能交联试剂如硫代琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯以将半胱氨酸残基加至一个或两个末端;用于进行这类连接的优选试剂是硫代琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸酯和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯;
-为了促进肽彼此间的连接而将1-8个额外氨基酸(优选1-5个氨基酸，最好是1-3个氨基酸)加到肽的一个或两个末端，以便与载体或较大的肽或蛋白质偶联或改进肽的物理或化学性质。这类改变的例子包括加入N-或C-末端酪氨酸，通过酯化反应加入作为连接物的谷氨酸或天冬氨酸以及可通过形成Schiff碱或酰胺被连接的赖氨酸。如前所述，这类额外氨基酸可包括任何天然氨基酸、D-构型氨基酸以及已知的非天然、合成的和修饰的氨基酸;及-通过例如酰化或酰胺化对肽的一个或两个末端进行衍化。这类修饰导致肽上为电荷的变化，并可进行肽与固相载体、载体或另一肽的共价连接。能够有效促进肽偶联或改进改善肽免疫原性或抗原性的取代基的例子有C2-C16酰基、聚乙二醇和磷脂。
可利用任何生产肽的常规方法来制备本发明肽。这类常规方法包括合成法、重组DNA技术及结合使用这两类方法。我们更偏爱的是固相合成法。在该合成方法中，所用的树脂载体可以是固相肽制备领域中常用的任何合适树脂。优选的是对-苄氧醇聚苯乙烯树脂或对-甲基苄胺(P-methylbenzydrylamine)树脂。在第一个被保护的氨基酸与树脂载体偶联后，利用本领域中所使用的常规方法除去氨基保护基。除去氨基保护基后，按照所需顺序依次偶联其余被保护的氨基酸，以及根据需要偶联的侧链被保护的氨基酸，从而得到所选择的肽。或者，在用树脂支持的氨基酸序列进行偶联之前，利用溶液法偶联多个氨基酸基团。
可根据所确定的技术选择适当的偶联剂。例如，适宜的偶联剂有N，N′-二异丙基碳二亚胺或N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯，它们可单独使用，但最好是在有1-羟苯并三唑存在的情况下使用。另一有用的偶联方法是使用被保护氨基酸所形成的对称酐。
尽管在偶联条件下不降解且任何其它保护基已存在于生长的肽链中的情况下易于被选择性除去可以使用任何其它合适的保护基，但用于将每一氨基酸加至生长中的肽链上所必需的α-氨基保护基最好是9-芴基-甲氧羰基(FMOC)。
选择侧链氨基酸保护基的标准是(a)在合成的每一步骤中选择用于除去α-氨基保护基的反应条件下保护基对各种试剂的稳定性;(b)保护基重要性质的保留(即在偶联条件下不被剪切掉)和(c)保护基在肽合成结束后且在对肽结构无不利影响的条件下的可除去性。
本发明完全受保护的树脂支持的肽最好是在合适清洁剂如苯甲醚硫代苯甲醚、乙基甲基硫醚、1，2-乙二硫醇及相关试剂存在的情况下，于室温下用含50%-60%三氟乙酸的二氯甲烷溶液处理1-6小时而将其从对-苄氧基醇树脂上裂解掉。大部分对酸不稳定的侧链保护基也被同时除掉。更多抗酸的保护基一般是通过用HF处理而被除去的。
可按照本领域所熟知的方法将本发明的肽作为诊断试剂用于HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ或HTLV-Ⅱ相关抗体的同时检测。这类方法包括ELISA、血细胞凝集法、单点或多点检测法。
本发明的试验药盒最好包括酶联免疫吸附检测法(ELISA)在这一优选实施方案中，是将本发明的肽或几种肽的混合物吸附至或共价偶联至固相载体，如微量滴定板的孔上。令人惊奇的是，当首先将HTLV-Ⅰ/Ⅱ肽(或优选其混合物)加至孔中时(即在加入HIV1/2肽之前)，该检测法的敏感性被大大增强。因此，本发明优选的实施方案包括药盒以及该药盒的制备方法，其中HTLV-Ⅰ和Ⅱ的混合物被首先偶联至载体上，然后再将HIV-1和HIV-2肽(优选其混合物)偶联到载体上。
本发明检测方法所适用的固相载体包括有机和无机聚合物，如淀粉酶、葡聚糖、天然或被修饰的纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖、磁铁矿、多孔玻璃粉、聚偏氟乙烯(Kynar)和胶乳、试验容器(即玻璃或人造材料的试管、滴定板或比色杯)的内壁以及固相(即玻璃及人造材料的圆棒、末端增厚的圆棒、具有末端叶片或薄片的多孔圆棒)的表面。多孔塑料微量滴定板是特别适用且优选的固相载体。
可利用任何方法将能够有效增大所得药盒敏感性及特异性的任何数量的本发明肽及其混合物至固相载体上。我们优选将固相载体与溶于缓冲液中的本发明一个或多个肽的溶液接触。通常用于溶解肽并将其加至固相载体上的任何缓冲液均可利用，但我们优选使用0.05M碳酸钠-碳酸氢钠溶液(PH9.6)。
缓冲液中的肽浓度应足以使有效数量的肽吸附至固相载体的表面上。这些所用的术语“有效数量”是指固相载体上能够分别有效地检测生物样品中的抗HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ或HTLV-Ⅱ抗体的肽量。
按照本发明，用于涂覆微滴定板的孔的肽溶液中的肽浓度较好在5μg/ml-10μg/ml之间，为10μg/ml更好。如果该溶液中仅有一种肽，则肽浓度为该单一肽的浓度，如果该渗液中有几种肽，则肽浓度为这几种肽的总浓度。本发明的肽混合物通常且优选是通过将含有5μg/ml-10μg/ml本发明各个肽的溶液相混合而制得。例如，若要制备两种肽的混合物，则将在5μg/ml-10μg/ml之间选定量的肽1溶液与5μg/ml-10μg/ml之间选定量的肽2溶液混合，其结果是所产生的混合物中总的肽浓度为5μg/ml-10μg/ml，且最好为10μg/ml。
选定用于制备本发明肽混合物的具体量主要是凭经验通过测试所产生的药盒在测定抗HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的敏感性和特异性而决定的。因此，用于混合以形成肽混合物的肽溶液的实际量可独自在上述参数范围内变化，以使所产生的检测药盒的敏感性和特异性达到最大值。已认识到肽混合物无需含有等量的每一种肽。事实上，我们更喜欢使用所含BCH-408和BCH-202ck均多于BCH132且所含BCH456多于BCH234及BCH416的肽混合物。
在本发明一优选实施方案中，我们是在将肽加至固相载体上之前将HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ肽溶液(5μg/ml-10μg/ml，优选10μg/ml)结合以形成HTLV肽混合物。同样，我们也喜欢在将其加至固相载体上之前将HIV-1和HIV-2肽溶液(5μg/ml-10μg/ml，优选10μg/ml)结合以形成HIV肽混合物。用于本发明的药盒中的优选肽组合物为(1)按1∶40∶60的比例含有BCH-132、BCH-202ck和BCH-408的HIV-1/2肽混合物，和(2)按1∶1∶4的比例含有BCH-234、BCH-416和BCH-456的HTLV-Ⅰ/Ⅱ肽混合物。当然，为了使所产生的药盒的敏感性和特异性达到最大程度，也可改变本发明其它检测药盒中的肽的比例及浓度。
按照本发明，利用常规技术将肽溶液与孔接触。在孔是用每一种肽分别包被的实施方案中，我们通常使用60μl第一种肽溶液;120μl第二种肽溶液;180μl第三种肽溶液和240μl第四种肽溶液。这将使得孔的不同表面将被每一种肽包被。在使用HTLV混合物及HIV混合物的优选实施方案中，由于同样的原因，我们通常使用120μlHTLV混合物及240μlHIV混合物。
肽溶液或肽混合物与固相载体接触的时间应足以使有效量的肽或肽混合物吸附至载体材料的表面上。在室温下1小时就足够。但是，在4℃时我们通常是使肽与孔接触过夜。在此之后，我们更喜欢除去所有未偶联的肽。可利用从固相载体上除去过量液体的任何常规方法来完成这一步骤。我们优选利用抽收法。吸出之后，也可用洗涤缓冲液如磷酸钠缓冲液(NaCl，0.15M;NaH2PO4，0.06M乙基汞硫代水杨酸钠，0.01%和Tween20，0.05%;PH7.4)洗涤孔。但是，这一洗涤步骤并不是必需的。吸出和/或洗涤之后，可通过重复上述应用步骤加进其它肽或其混合物。
在本发明的另一实施方案中，我们并未在使孔与下一个肽或混合物接触之前从孔中除去过量的第一种肽或混合物。在该实施方案中，我们优选使用约等量的每一种肽或混合物。例如，如果单独使用单一的肽溶液，我们将使用60μl的第一种肽，并在1小时后加入60μl的第二种肽，以此类推。如果使用的是HTLV和HIV肽的混合物，我们将使用120μlHTLV混合物，并在1小时后加入120μlHIV混合物。再过1小时后，除去过量溶液，并通常用缓冲液洗孔。
在所需肽被偶联到载体材料上且除去任何过量材料后，用所要测试的生物样品处理各孔。该样品最好是血清，但也可使用血液、血浆、唾液、尿液、眼泪、乳汁或脑脊髓液等其它样品。也可在检测前用样品缓冲液稀释生物学样品。这种缓冲液的一个例子是磷酸钠缓冲液(磷酸钠，6mM;NaCl，0.15N;BSA，2%;胨，1.5%;苄脒，80mM;Tween20，1%;热灭活的羊血清，40%;乙基汞硫代水杨酸钠，0.01%，最终PH为7.2)。每孔所加样品溶液的量最好等于用以包被孔的最大量的六分之五。例如，若使用240μl肽溶液包被孔，则优选的所加样品溶液的量将为200μl。
在暴露于所要分析的样品后将孔例空(最好通过抽吸法)并洗涤之。洗涤之后，将过氧化物酶标记的抗人IgG或抗人IgM加至孔中。对过氧化物酶的测定通常是用相应的底物，如3，3′，5，5′-四-甲基联苯胺完成的。在不背离这一举例检测法之适用性的情况下，可用另一种标记物如放射活性的、荧光、化学发光或红外发射或吸收标记物代替过氧化物酶。
以下提供了合成和利用本发明肽的一般步骤。
步骤1制备携带了N-FMOC保护的氨基酸残基的树脂于0℃下将加在二氯甲烷(CH2Cl2)和二甲基甲酰胺(DMF)混合物(4∶1)中的所需N-FMOC保护的氨基酸残基加到对-苯氧基醇树脂在CH2Cl2∶DMF(4∶1)中的悬浮液中。手工搅拌该混合物数秒钟之后，先用N，N′-二环己基-碳二亚胺(DCC)处理，接着用催化量的4-(二甲基氨基)吡啶处理。将该混合物于0℃下搅拌30分钟，再于室温下搅拌过夜。依次用CH2Cl2、DMF和异丙醇(各洗3次)，最后用CH2Cl2洗涤过滤树脂。将树脂悬浮于CH2Cl2中，浸入冰浴冷却，并向搅拌过的悬浮液中加入重蒸馏过的吡啶，接着加入苯甲酰氯。于0℃下继续搅拌30分钟后再于室温下搅拌60分钟。过滤后，连续用CH2Cl2、DMF和异丙醇(各3次)，接着再用石油醚(两次)洗涤树脂。最后高真空干燥至恒定重量。
按照Mecenhofer等人(INt.J.PeptideProteinRes，13，35，1979)的方法对取代进行分光光度测定，以显示树脂上的取代程度。
步骤2继后氨基酸的偶联将携带N-FMOC保护的第一个氨基酸残基的树脂置于Biosearch9600肽合成仪的反应容器中，并按以下步骤处理之1)用DMF洗(4次，每次20秒)
2)用30%哌啶的DMF溶液预洗(3分钟)3)用30%哌啶的DMF溶液去保护(7分钟)4)用DMF洗(8次，每次20秒)5)检测游离氨基-Kaiser试验(必须为阳性)6)然后将肽树脂与8当量的所需FMOC-保护的氨基酸和1-羟基苯并三唑及苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)磷六氟磷酸酯一起温和振荡1或2小时，以上成分均溶于含有16当量4-甲基吗啉的重蒸馏的无水DMF中。
7)用DMF洗(6次，每次20秒钟)。
在步骤7之后，取等分试样进行茚三酮试验。如果试验为阴性，则可回到步骤1，接着偶联下一个氨基酸。如果试验为阳性或轻微的阴性，则应重复步骤6和7。
以上方案可用于偶联本发明所述肽中的每一个氨基酸。在整个合成过程中也可用FMOC对每一个余留的氨基酸进行N-保护。
利用上述偶联方案，通过加进氘化氨基酸可制备出放射性标记的肽。
最后一个氨基酸被加入后，通过回到上述程序的步骤1-7而除去N-末端残基的N-FMOC。经CH2Cl2洗涤肽树脂及真空干燥后得到被保护的肽粗制品。
步骤3去保护并从树脂上切下肽将被保护的肽-树脂悬浮于含有2.5%乙二硫醇和2.5%苯甲醚的55%三氟乙酸(TFA)(溶于CH2Cl2)的溶液中，用N2冲洗混合物并在室温下搅拌1.5小时。过滤混合物，并用CH2Cl2洗树脂，再用20%TFA的CH2Cl2溶液及CH2Cl2洗涤树脂。于35℃以下真空蒸发合并的滤液，并用无水二甲醚多次研制残余物。将该固体物溶于10%的乙酸水溶液并冷冻干燥后得到粗产品。
在苯甲醚和二甲硫存在下，用HF0℃下处理1小时，使含有arg和cys残基的肽进一步去保护。用10%乙酸水溶液提取肽，用二甲醚洗涤异冷却干燥后得到粗肽。
步骤4肽的纯化在具有流动相梯度的C18或C4逆相Vydac柱(2.5×25mm)上通过制备性HPLC纯化粗肽。于220nm处监测洗脱液，随后作分析性HPLC检测。合并有关级份，蒸发并冷冻干燥。可通过分析性逆相层析和氨基酸分析进一步证实对合成肽所作的鉴定。
步骤5利用酶联免疫吸附法(ELISA)同时检测抗HIV-1HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体将合成肽溶于0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(PH9.6)中，形成肽浓度约为5μg/ml-10μg/ml的肽溶液。然后通过混合一定量的这些个别肽溶液而制成两种肽的混合物。第一种混合物包括HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的合成肽，第二种混合物包括HIV-1和HIV-2的合成肽。每种混合物的总肽浓度为5μg/ml-10μg/ml。
首先将HTLV-Ⅰ/Ⅱ混合物加至孔中。然后将HIV-1/2肽混合物偶联到载体上。在下面的实例中，首先是将120μlHTLV-Ⅰ/Ⅱ衍生的合成肽混合物加至每孔中，并将平板于4℃下保温过夜。然后将孔倒空，充入240μlHIV-1/2衍生的合成肽混合物。将平板于4℃下保温过夜。我们利用OysterBayVersafill分散系列充填各孔。通过抽吸将孔抽空，并用洗涤缓冲液(NaCl，0.15M;NaH2PO4，0.06M;乙基汞硫代水杨酸钠，0.01%和Twecn20，0.05%;PH7.4〔0.3ml/孔〕)冲洗两次。然后将孔于37℃下用0.35ml洗涤缓冲液饱和1小时。于37℃干燥空平板1小时，并真空包装待用。
用样品缓冲液(磷酸钠，6mM;NaCl，0.15M;BSA，2%胨，1.5%;苄脒，80mM;Tween20，1%，热灭活的羊血清，40%;乙基汞硫代水杨酸钠，0.01%最终PH7.2)稀释所要分析的血清样品，并将稀释过的血清样品(0.2ml)加至孔中，填充后的孔于室温下保温30分钟。然后将孔倒空，用洗涤缓冲液洗5次。
将用1%W/V的牛血清白蛋白〔在含有Tris(0.05M)、NaCl(0.5M)、Tween20(0.05%)、乙基汞硫代水杨酸钠(0.01%)(PH7.2)的溶液中〕稀释连接溶液(用过氧化物酶标记并亲和纯化的羊抗人IgG抗体;0.5mg加在5ml50%甘油中)加到各孔中(每孔0.2ml)并于室温下保温30分钟。然后将孔倒空并用洗涤缓冲液洗5次。用含有0.015%V/V之30%H2O2的5倍体积的过氧化物溶液稀释存在于乙酸缓冲液(0.1M;PH5.6)中的底物溶液(2mg/ml3，3′，5，5′-四甲基-联苯胺的N-甲基吡咯烷酮溶液(NNP))，并加至每孔中(每孔0.2ml)30分钟后，用0.1ml1NH2SO4处理各孔的内容物，并于450nm处读出光密度。所有测定均进行两次。
利用与上面所述基本相同的步骤制备出以下所讨论的具体的肽，然后估价它们检测HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ特异性抗体的能力。
实验1在该实验中，HTLV-肽混合物的总肽浓度为10μg/ml且由1∶1∶1的BCH-219、BCH-234和BCH-416混合物组成，其中每一种肽均按步骤5所述以10μg/ml的浓度首先被溶于碳酸盐缓冲液中。如前所述，将120μl该HTLV-Ⅰ/Ⅱ合成肽混合物加至每孔中并于4℃保温过夜。将孔倒空，加入240μlHIV-1/2肽混合物。将3体积的BCH-408肽溶液(10μg/ml)与2体积的BCH-202ck溶液(10μg/ml)混合可形成该HIV-1/2混合物，其总肽浓度为10μg/ml，所含BCH-408和BCH-202ck的比例为3∶2。按步骤5所述方法吸附存在于该第二混合物中的肽并进一步处理平板。也利用120μl每种肽混合物制备两套平板(即一套为HIV-1/2衍生的合成肽，一套为HTLV-Ⅰ/Ⅱ衍生的合成肽)。将这些平板(HIV-EIA和HTLV-EIA)与HTLV/HIV结合平板(结合的HIV/HTLV-EIA)一起用于平行研究，以比较它们测定血清样品中抗HIV和HTLV抗体的效力，表1显示了这一比较的结果。
表1
表1(续)
表1的结果代表信号/中止比。中止为得自三个正常供血者的血浆样品的平均吸收率(其中的加入量为0.10)。该比率大于或等于1.0表示为阳性样品。
表1中标示为“NC”的样品为阴性对照，它得自证实为HIV-1/2阴性和HTLV-Ⅰ/Ⅱ阴性的患者。标示“PC”的样品为阳性对照，它得自分别被证实仅为HIV-1阳性、仅为HIV-2阳性、仅为HTLV-Ⅰ阳性及仅为HTLV-Ⅱ阳性的患者。标示“A02”(1-25)、“C”(20-25)和“G”(80-86)的样品得自BostonBiomedicalnc.(BBI)。其状态由BBI测定。“Ind”表示模糊的Western印迹图。“HIV-1Seroc.”表示这些血浆样品相继采自后来发现已受HIV-1感染的供血者。在对同样抗体试验为阴性数周后，这些患者产生了抗HIV-1抗体。按年月顺序对样品进行编号。
一般来说，用HIV/HTLV结合平板测得的信号/中止与单独用HIV肽或单独用HTLV肽包被的平板所测得的结果差不多。这是一令人惊奇的结果，因为一般认为在识别特定抗体的抗原决定簇被稀释后信号会显著减少。在共感染的HIV/HTLV样品(即A02-4)中，用HIV/HTLV平板测得的信号/中止比(＞12)远远高于用仅由HTLV肽包被的平板所测得的比值(2.95)。
在HIV平板及结合的HIV/HTLV平板上同时测定患者C和G从抗HIV-1阴性向抗HIV-1阳性的HIV-1血清转化。
尽管结合的HIV/HTLV平板与HTLV肽包被的平板同样有效，但在几种情况下(样品A02-3，A02-13和A02-17)无论是在结合的HIV-HTLV或单一的HTLV平板上均未测得含有抗HTLV-Ⅱ抗体的样品为阳性。对其它的混合物同样进行装配和测试以试图改善对HTLV抗体的敏感性。
实验2本实验与上述实验非常相似。两种肽混合物的组成如下HTLV肽混合物含有的总肽浓度为10μg/ml且包括比例为1∶1∶4的BCH-234、BCH-416和BCH-456，它是使用个别的10μg/ml肽溶液制得的。HIV肽混合物含有的总肽浓度为5μg/ml且包括比例为1∶40∶60的BCH-132、BCH-202ck和BCH-408。它由个别的5μg/ml肽溶液制得。表2显示了对用这些肽包被的孔进行检测所获得的结果。
表2
表2(续)
表2所示结果说明该新肽组合物对HTLV特异性抗体的敏感性大大提高。例如，利用新肽混合物时样品A02-3由0.69(表1)增加至1.08。使用实验1的混合物时为低阳性(1.02-1.70)的8个样品，在改用实验2的肽混合物后产生很强的阳性信号/中止比(1.93-9.79)。
对HIV抗体检测的敏感性也得到改进，但程度较低。最值得注意的是样品C-22信号/中止比的增加(从0.60增至0.89)。这一增加使样品被分类为“边界线阴性”。在许多实验室中，要对边界线阴性样品作进一步测试，且极有可能被检测为阳性。
利用具有同样的肽比例且按实验2所述方法制得的平板进行另一套试验以进一步评估其敏感性和特异性。表3a和3b总结了所得数据。
表3a
表3b
＊两种样品均被证实为抗HIV-1阳性。
以上结果说明由该检测药盒所显示的敏感性极强。在表3a中，利用结合的HIV/HTLV试验药盒已正确地测出含有抗HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的每一个样品均为阳性。这些样品中包括含有极低浓度抗HIV-1抗体的低滴度血清样品组。
表3b举例说明了由该检测药盒显示的极好特异性。在1295份筛选的样品中，仅证实了1个假阳性。这一特异性程度明显地好于约99.5%的可接受范围。
尽管本发明提供了许多实施方案，但利用本发明的方法和组合物对本发明进行某些改动后可提供其它实施方案。因此，本发明的范围是由所附权利要求书而不是本说明书中所提供的具体实施方案来限定的。
权利要求
1.用于同时检测抗HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的免疫检测药盒，它包括四组肽中每一组的至少一种肽，且被偶联到固相载体上，这四组肽具有通式a-X-b、a-Y-b、a-Z-b和a-W-b，其中X选自Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr ThrAla Val Pro Trp Asn Ala Ser(BCH-87C)Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr ThrAla Val Pro Trp Asn Ala Ser(BCH-87ck)Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys ArgArg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg(BCH-132)Lys Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys ThrThr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser(BCH-266)Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr ThrAla Val Pro Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile(BCH-408)Lys Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys ThrThr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile (BCH-408k)及其类似物；Y选自Arg Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser (BCH-202c)Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser (BCH-202ck)Lys Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala
Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys HisThr Thr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser (BCH-265)Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tys Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser Ala Phe Arg Gln Val (BCH-417)Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser Gly Lys His Ile (BCH-422)及其类似物；Z选自Pro His Ser Asn Leu Asp His Ile Leu Glu Pro Ser Ile ProTrp Lys Ser Lys Pro Tyr Val Glu Pro Thr Ala Pro Gln ValLeu (BCH-234)Ala Ile Val Ser Ser Pro Ser His Asn Ser Leu Ile Leu ProPro Phe Ser Leu Ser Pro Val Pro Thr LeuGly Ser Arg (BCH-416)及其类似物；W选自Leu Val His Asp Ser Asp Leu Glu His Val Leu Thr Pro SerThr Ser Trp Thr Thr Lys Ile Leu (BCH-219)Thr Ser Glu Pro Thr Gln Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro LeuLeu Val His Asp Ser Asp Leu Glu His Val Leu (BCH-456)Thr Ser Glu Pro Thr Gln Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro LeuVal His Asp Ser Asp Leu Glu His Val Leu (BCH-486)及其类似物；a为氨基末端，1-8个氨基酸或能够有效促进肽偶联或改进肽免疫原性或抗原性的取代基；b为羧基末端，1-8个氨基酸或能够有效促进肽偶联或改进肽免疫原性或抗原性的取代基。
2.根据权利要求1所述的药盒，其中肽是通过固相合成法制得的。
3.根据权利要求1所述的药盒，其中偶联至固相载体上的HIV-1肽为Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys ArgArg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg (BCH-132);和Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr ThrAla Val Pro Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile (BCH-408)且偶联至固相载体上的HIV-2肽为Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg
Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His ThrThr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser (BCH-202ck).
4.根据权利要求1所述的药盒，其中偶联至固相载体上的HTLV-Ⅰ肽为Pro His Ser Asn Leu Asp His Ile Leu Glu Pro Ser Ile ProTrp Lys Ser Lys Pro Tyr Val Glu Pro Thr Ala Pro Gln ValLeu (BCH-234);和Ala Ile Val Ser Ser Pro Ser His Asn Ser Leu Ile Leu ProPro Phe Ser Leu Ser Pro Val Pro Thr Leu Gly Ser Arg(BCH-416)且偶联至固相载体上的HTLV-II肽为:Thr Ser Glu Pro Thr Gln Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro LeuLeu Val His Asp Ser Asp Leu Glu His Val Leu (BCH-456).
5.根据权利要求1所述的药盒，其中固相载体为多孔塑料微量滴定板。
6.制备权利要求1的免疫检测药盒的方法，它包括以下步骤(a)首先将HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ肽偶联到固相载体上;(b)然后将HIV-1和HIV-2肽偶联到固相载体上。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所说的HTLV-Ⅰ肽、HTLV-Ⅱ肽、HIV-1肽和HIV-2肽在偶联至固相载体上之前均使用0.05M碳酸钠、碳酸氢钠缓冲液分别稀释成HTLV-Ⅰ肽溶液、HTLV-Ⅱ肽溶液、HIV-1肽溶液和HIV-2肽溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所说的HTLV-Ⅰ肽溶液、HTLV-Ⅱ肽溶液、HIV-1肽溶液和HIV-2肽溶液中各个肽的浓度为5μg/ml至10μg/ml。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所说的HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ肽溶液在偶联到固相载体上之前被混合成HTLV肽混合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所说的HTLV肽混合物的总肽浓度为5μg/ml至10μg/ml。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所说的HIV-1和HIV-2肽溶液在被偶联到固相载体上之前被混合成HIV肽混合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所说的HIV肽混合物的总肽浓度为5μg/ml至10μg/ml。
13.使用权利要求1之免疫检测药盒的方法，它包括以下步骤(a)将生物学样品加到固相载体上;(b)从固相载体上除去过量的生物学样品;(c)洗涤已包被的固相载体;(d)用合适的标记物处理洗过的固相载体;(e)检测固相载体上标记物的存在。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所说的生物学样品系选自血液、血浆、血清、唾液、尿液、眼泪、乳汁和脑脊髓液。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所说的生物学样品为血清。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所说的生物学样品在加到固相载体上之前首先被样品缓冲液稀释。
17.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(b)是通过抽吸完成的。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所说的标记物为过氧化物酶标记的抗人免疫球蛋白G或过氧化物酶标记的抗人免疫球蛋白M。
全文摘要
本发明涉及用于同时检测生物学样品中抗HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ抗体的免疫检测药盒。本发明也涉及该免疫检测药盒的制造和使用方法。
文档编号G01N33/569GK1070484SQ9210885
公开日1993年3月31日 申请日期1992年7月29日 优先权日1991年7月29日
发明者M·拉克劳西, R·J·德怀尔, M·兹莱 申请人:生物化学药物有限公司