一种抗bpi-anca抗体检测试纸条的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测BPI-ANCA的免疫 层析检测试纸的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 炎症性肠病（inflammatoryboweldisease，IBD)是一种病因尚不十分清楚的 慢性非特异性肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病 (Crohn'sdisease，CD)。克罗恩病于 1932 年由Crohn、Ginzterg和Oppenheime最早描 述，故得此名。1973年，世界卫生组织医学科学国际组织委员会将本病定名为Crohn病。其 特点为病因未明，多见于青年人，表现为肉芽肿性炎症病变，合并纤维化与溃疡。可侵及全 胃肠道的任何部位，包括口腔、肛门，病变呈节段性或跳跃性分布，并可侵及肠道以外，特别 是皮肤。临床表现因病变部位、范围及程度不同而多样化，病程缓慢，易复发。
[0003] IBD是北美和欧洲的常见病，近30年来日本IBD发病率亦呈逐步增高趋势，我国虽 尚无普通人群的流行病学资料，但近10多年来本病就诊人数呈逐步增加趋势则非常明显。 IBD的临床表现复杂多样，不仅有消化道症状，还可有肠外表现。由于症状为腹痛、腹泻、便 血等非特异性肠炎表现，⑶与UC、以及IBD与结核性肠炎等其他肠道慢性疾病很难鉴别诊 断，特别在缺乏组织学证据时，需有更多相对特异性的标志物为诊断提供帮助。研宄发现， 多种非侵入性的生物活性标志物对IBD的诊断及炎症活动性的评价具有重要意义。
[0004] 明确具有诊断价值的血清特异性抗体标记物包括核周型抗中性粒细胞抗体 (pANCA)、抗酿酒酵母抗体（ASCA)、抗胰腺腺泡抗体（PAB)、抗细胞外膜蛋白复合物抗体 (OmpC)、12抗体和鞭毛蛋白（包括CBirUFlaX和A4-Fla2)等。其中抗中性粒细胞胞浆抗 体（anti-neutrophilcytoplasmicantibody，ANCA)ANCA是以中性粒细胞和单核细胞胞衆 成分为抗原的自身抗体。研发发现，与IBD相关的ANCA抗原蛋白主要包括通透性杀菌蛋白 BPI-ANCA、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MP0-ANCA)，以及PR3-ANCA。王琼等报道（齐齐 哈尔医学院学报2010年第31卷第23期），约46. 9%的pANCA阳性的UC患者为BPI-ANCA 抗体阳性，而⑶患者中PBI-ANCA抗体阳性率只有3. 3%，提示该指标可用于有效鉴别UC和 CD。BPI是一类阴离子抗菌蛋白，由于BPI有结合脂多糖、中和内毒素的作用，是宿主反应 中中性粒细胞杀灭革兰阴性杆菌的活性蛋白。因此它是粒细胞防御和清除外界感染的重要 因子。UC患者BPI-ANCA抗体的出现可能与机体在某种微生物感染后，触发中性粒细胞BPI 的合成和释放增加，而机体的免疫识别及调节的异常可产生针对BPI的自身抗体。
[0005] 现有BPI-ANCA的检测方法主要有两种：间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescenceassay,IIF)和酶联免疫吸附法（Enzymelinkedimmunosorbent assay，ELISA)oELISA法检测可用于高通量标本测定，灵敏度也比较高，目前也被广泛认可， 但其操作比较繁琐，需要多次加样洗涤及孵育步骤，完成整个实验过程需要3小时左右，需 要酶标仪，对于实验人员专业技术要求比较高，同时受到各种环境条件的影响，对实验带来 诸多不便。
[0006] 间接免疫荧光检测技术是把抗原细胞固定在载玻片上，荧光染色用荧光显微镜进 行观察，该技术具有高特异性，但由于显微镜观察需要主观判断，对检验人员的要求高，并 且依赖于荧光显微镜，使用不便。
[0007] 免疫层析法（Immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其 原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的纤维 素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至 固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检 测带。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、彩色胶乳等等， 其中以纳米金应用最为广泛，纳米金也称为胶体金。
[0008] 以胶体金作为失踪标记物的免疫层析技术特称为免疫胶体金技术（Immune colloidalgoldtechnique，GICT)。胶体金是由氯金酸（HAuC14)在还原剂如白磷、抗坏血 酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定 的胶体状态而得名。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢 固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质 结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物 理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而 使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0009] 表面带活性基团的彩色胶乳微球也可以作为免疫层析的示踪剂，与胶体金技术一 样，彩色胶乳标记免疫层析技术也具有操作简便、试剂稳定、快速出结果、可室温保存等优 点。彩色胶乳标记是将不同直径范围〇.IUM~IUM彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基 等酯类或其他大分子物质共价结合，使这些大分子标记上颜色，当在检测线或质控线上富 集停留后形成肉眼可见的彩色条带。
[0010] 与现有技术ELISA和IFA相比，免疫层析法检测的优点主要包括：（1)使用方便 快速，便于基层使用和现场使用，所有反应能在20分钟内完成；（2)成本低，不需要特殊的 仪器设备；（3)应用范围广，可适应多种检测条件；(4)可以进行多项检测，若阳性样本比较 难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；（5)标记物稳定，标记样品在4°C贮存两年年以 上，无信号衰减现象；(6)胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性 底物及终止液的步骤，对人体无毒害。
[0011] 在自体免疫性疾病诊断方面，已出现较多的免疫层析试纸，但基于抗BPI-ANCA抗 体检测的免疫层析试纸在国内外市场上仍没有问世。
【发明内容】
[0012] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将免疫层析法应用到抗 BPI-ANCA抗体的检测中，采用间接免疫法来实现对样品中的抗BPI-ANCA抗体进行检测，通 过把BPI-ANCA抗原蛋白包被在结合垫或分析膜的检测带上，实现对样品中抗BPI-ANCA抗 体的高特异、高灵敏度、高准确性的检测，快速筛查抗BPI-ANCA抗体阳性标本，为临床炎症 性肠病等自体免疫性疾病提供快速的辅助诊断。
[0013] 本发明的目的之一在于提供一种快速、准确的抗BPI-ANCA抗体的免疫层析检测 试纸条及制备方法，目的之二是提供一种基于免疫层析技术的抗BPI-ANCA抗体检测方法。
[0014] 作为本发明第一个方面的一种抗BPI-ANCA抗体的免疫层析检测试纸条，包括样 品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和底板，分析膜上设置检测带和质控带，所述底板的上部贴合 有分析膜，分析膜上部的两端分别贴合有结合垫和吸水垫，结合垫上部的一端贴合有样品 垫。
[0015] 所述的结合垫（2)包被胶体金标记物或彩色胶乳标记物。
[0016] 所述的结合垫为1层（图1)或2层（图2)，其中2层时错落与分析膜搭接。
[0017] 所述检测带⑷设1条或2条，用于同时或分别检测BPI-ANCA抗体的IgG型和 IgA型。
[0018] 所述抗BPI-ANCA抗体的免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0019] 步骤I.BPI-ANCA抗原蛋白的制备
[0020] 步骤2.结合垫⑵制备
[0021] (1)纳米金标记物的制备：用纳米金溶液标记BPI-ANCA抗原蛋白、抗人IgG抗体、 抗人IgA、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（ProteinG)，以及其他与质控带C线能形 成免疫复合物的蛋白。
[0022] (2)彩色胶乳标记物的制备：用带活性氨基或羧基基团的彩色胶乳标记BPI-ANCA 抗原蛋白、抗人IgG抗体、抗人IgA葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（ProteinG)，以 及其他与质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。
[0023] (3)结合垫（2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，先用含BSA和糖的缓冲液 预处理并烘干，将步骤（1)制备的纳米金标记物或胶乳标记物，用喷涂仪喷涂在预处理的 玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。
[0024] 步骤3.分析膜（3)制备
[0025] (1)检测带T线⑷制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被蛋白，如 结合垫上的结合蛋白含BPI-ANCA，检测带T线的包被蛋白是抗人IgG或/和IgA。如果结 合垫上含有抗人IgG或/和IgA，检测带T线包被蛋白为BPI-ANCA。
[0026] (2)质控带C线（5)制备：根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白，如 结合垫标记蛋白是单一的BPI-ANCA，质控带C线的包被蛋白为抗BPI-ANCA的抗体；如果结 合垫标记蛋白是单一的抗人IgG或IgA抗体，质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG或 IgA抗体的抗体；或者其他结合垫标记蛋白形成免疫复合物的蛋白。
[0027] 步骤4.样品垫制备
[0028] 将玻璃纤维