膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用，或者直接使用。
[0029] 步骤5?试纸条组装
[0030] 把步骤1~4所制作完成的材料，按图1或图2搭接，根据底板的规格切割成一定 的长度和宽度，安装在底板和卡壳里。优选地，试纸条长度为6. 5cm，宽度为3_或4_。
[0031] 所述的BPI-ANCA抗原蛋白是把全长BPI-ANCA基因或者含有重要抗原表位的基因 序列，克隆到原核或真核表达载体里，表达纯化获得。
[0032] 所述的BPI-ANCA抗原蛋白是用多肽合成仪合成含有BPI-ANCA重要抗原表位的 BPI-ANCA多肽，并偶联到载体蛋白上而获得。
[0033]所述的抗人IgG抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种 单克隆抗体或多克隆抗体。
[0034] 所述的抗BPI-ANCA的抗体是以BPI-ANCA为免疫源，鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼 源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。
[0035] 所述的抗人IgG抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的抗体，比如该抗人 IgG抗体是鼠抗人IgG，它的抗体是羊抗鼠IgG的抗体或其他非鼠源的鼠IgG抗体。
[0036] 在本发明的另一方面，提供一种抗BPI-ANCA抗体检测方法，用本发明第一方面方 法及步骤所制备的抗BPI-ANCA抗体免疫层析试纸条，对待检样品进行检测，具体步骤：
[0037] (1)样本处理：取血清、血浆或全血样本，用加样缓冲液稀释0~100倍；
[0038] (2)把上述处理过的样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5~20分钟，观察T线和 C线；
[0039] (3)结果判读：T线和C线均显现，结果为阳性；T线不显现，C线显现，结果为阴性； T线和C线均不显现，提示试纸失效。
[0040] 本发明的检测原理：
[0041] 选用金标/胶乳等标记BPI-ANCA抗原蛋白或其他能与待检样品中目的物结合的 蛋白，喷涂在结合垫上，制成结合垫；在检测带上包被能与标记蛋白-目的物蛋白复合物 发生免疫反应的蛋白，当把待检样本加样到样品垫上后，样本中的BPI-ANCA抗体与结合垫 上的标记蛋白形成免疫复合物，由于毛细管效应，该复合物向吸水垫方向泳动，此复合物 与包被于检测带T线上的抗原蛋白发生特异性免疫结合反应，形成金标/胶乳蛋白-抗 BPI-ANCA抗体-BPI-ANCA抗原蛋白三联体复合物而被截留在检测线上，逐渐富集形成较深 的紫红色条带或胶乳颜色；由于毛细效应继续泳动向前，金标/胶乳兔IgG与包被在质控线 上的羊抗兔IgG发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带 或胶乳颜色，多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线和质控线都出现条 带的判为阳性结果；若血清样品中不含有抗BPI-ANCA抗体，标记蛋白到达检测线时，不与 包被在检测线上的相应蛋白发生免疫反应，因此在检测线处没有出现显色带，而金标/胶 乳兔IgG继续泳动向前与包被于质控线处的相应包被蛋白发生特异的免疫反应而被截留， 逐渐富集在质控线上形成紫红色条带或胶乳颜色，因此仅在质控上出现条带判为阴性结 果。
[0042] 本发明首次将免疫层析技术应用于抗BPI-ANCA抗体检测，实现了高特异性、高灵 敏度的检测性能。与现有文献报道的ELISA和化学发光试剂盒相比，本发明的优点主要包 括：检测时间短（5~20min);不需要任何特殊仪器，可实现床边检测和门诊即时检测；操 作简便，只需一步反应，操作人员无需培训，检测成本低；对温度无特殊要求，无需冷冻，储 存运输方便，室温可保存24个月。
【附图说明】
[0043] 图1本发明检测带T线1条时的侧面结构示意图1。
[0044] 图2本发明检测带T线1条时的侧面结构示意图2。
[0045] 图3本发明检测带T线2条时的侧面结构示意图3。
[0046] 图4本发明检测带为1条时阳性和阴性结果示意图4。
[0047] 其中4a是条带示意图；4b为阳性结果；4c为阴性结果；4d和4e表示试纸条失效。
[0048] 图5本发明检测带为2条时阳性和阴性结果示意图5. 其中5a是条带示意图；5b为IgG和IgA均阳性；5c为IgG阳性，IgA阴性；5d为IgA阳性，IgG阴性；5e为阴性结果；5f和5g表示试纸失效。
【具体实施方式】
[0049] 本发明所述的BPI-ANCA抗体检测免疫层析试纸，如图1所示，该试纸是在底板（7) 上由一侧向另一侧顺次相互搭接地粘贴分析膜（3)、结合垫（2)、样品垫（1)、吸水垫（6)。
[0050] 结合垫（2)上喷涂有金标/胶乳标记蛋白，分析膜（3)上设置检测带（4)和质控 带（5)，根据结合垫上标记蛋白的不同，选用相应的检测带包被蛋白和质控带包被蛋白。优 选地，在结合垫上喷涂的标记蛋白为BPI-ANCA抗原蛋白和鼠IgG，贝Ij检测带上的包被蛋白 为抗人IgG抗体或/和IgA，质控带上的包被蛋白为抗鼠IgG。另一优选，在结合垫上喷涂 的标记蛋白为抗人IgG抗体或/和IgA，贝Ij检测带上的包被蛋白为BPI-ANCA抗原蛋白。
[0051] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
[0052] 实施例I.BPI-ANCA抗原蛋白制备
[0053] 1)试剂
[0054]大肠杆菌宿主菌DH5a、BL21 (DE3)，克隆载体pCR2.IT-vector，表达质粒 pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA连接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性内切酶 BamHI、HindIII和EcoRI、BamHI，DL2000DNAMarker、T4DNA连接酶，低分子量标准蛋 白，DNA胶回收试剂盒，IPTG等
[0055] 2)仪器
[0056] 普通摇床SCS-24;隔水式恒温电热培养箱；Biophotometer分光光度计、台式冷冻 离心机Centrifuge5810R、台式离心机MiniSpin;高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝 胶成像系统；PCR仪；超声裂解仪；恒温金属浴；HIS蛋白纯化柱等。
[0057] 3)实验方法
[0058]设计引物CGCCATATGATGAGAGAGAACATGGCCAGG和CCGCTCGAGTCAITT ATAGACAACGTCTGC从模板DNA中PCR扩增出BPI-ANCA片段，胶回收试剂盒回收片段后 连接到pCR2. 1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a(+)中， 酶切位点为EcoRI、BamHI，同时载体上有6XHIS标签，便于后续的蛋白纯化。
[0059] b?表达
[0060] 将得到的质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。将筛选 出来的阳性菌液按1 : 1000的比例接种加有Kan抗性的LB培养基中，每个菌接种两管，一 管用于诱导，另一管用于非诱导对照，同时要接种一管空质粒菌作对照。37°C过夜培养至 0D600值约为0. 4-0. 6时，诱导管和空质粒对照管加入IPTG至终浓度为lmmol/L，非诱导对 照不加，最终选择表达能力高的两个菌，用于大量的蛋白的表达。并按照常规的SDS-PAGE 方法对表达产物进行鉴定。
[0061]c?纯化
[0062] 将表达的产物用HIS蛋白纯化柱纯化蛋白，并透析脱盐，经测定纯化后的蛋白浓 度为 509mg/L。
[0063]BPI-ANCA抗原蛋白制备方法2:筛选BPI-ANCA重要抗原表位多肽2-5个，用多肽 合成仪进行从从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成，然后与载体蛋白偶联，使分子量 增大，便于结合在结合垫和分析膜上。常用的载体蛋白包括但不限于牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（OA)、钥孔血蓝蛋白（KLH)、人血清白蛋白（HSA)及人工合成的多聚赖氨酸（PLL) 等。
[0064] 实施例2抗体制备
[0065] 结合垫及检测带包被抗体抗人IgG单克隆抗体和多克隆抗体，以及用于质控带和 结合垫其他动物来源的单克隆抗体和多克隆抗体，可通过免疫动物获得。
[0066] 1、单克隆抗体制备的具体操作方法为：
[0067] 1)通过将0? 05mg~Img免疫制剂（分别针对山羊或小鼠或兔子）与1倍体积的 弗氏完全佐剂混合得到注射溶液，将该注射溶液在动物皮内多部位注射；
[0068] 2) -个月后将动物用的人IgG的弗氏完全佐剂混合液经多部位动物皮下注射而 加强免疫。7~14天后将动物放血，测定抗血清滴度。
[0069] 3)对动物加强免疫直至滴度达到平台期。通过从被免疫的动物回收脾细胞与小鼠 骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选后即可得到能稳定表达目的抗体的杂交瘤细胞。
[0070] 4)体外培养的杂交瘤细胞，接种小鼠或大鼠腹腔，取腹水纯化获得单克隆抗体； 或者从培养上清液中纯化获得单克隆抗体。
[0071] 2、多克隆抗体制备：
[0072]同单克隆抗体步骤1)和2)，在获得抗血清后，纯化抗血清获得多克隆抗体。
[0073] 3、葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白制备
[0074] 根据葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白的基因序列，可通过大肠杆菌原核表达克隆 化基因来制备，具体操作方法可参见（分子克隆实验指南），或实施例1BPI-ANCA的步骤。
[0075] 实施例3胶体金层析各组分制备
[0076] (1)胶体金溶液制备
[0077] 用去离子水配制0? 01% (w/v)的氯金酸溶液