4mG/ mL的溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为IyL/cm。
[0133] (4)结合垫的制备
[0134] 结合垫的处理：结合垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的结合垫处理液浸 泡结合垫，结合垫处理液的量为100uL/cm2,然后在37°C下Ih烘干后，将抗体或者蛋白以 4uL/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上，37°C干燥Ih后得结合垫，结合垫置于2~8°C的 环境下备用；结合垫处理液的组成为：pH为7. 2的IOmMPB缓冲溶液，含1%BSA，10%蔗糖， 0. 1 %Tween-20。
[0135] 结合垫1双层，标记蛋白a层为BPI-ANCA抗原蛋白，标记蛋白b层为兔IgG。
[0136] 结合垫2双层，标记蛋白a层为proteinG，标记蛋白b层为鼠IgA。
[0137] 结合垫3单层，标记蛋白为羊抗人IgG与IgA的混合物。
[0138] 结合垫4单层，标记蛋白为豚鼠抗人IgG。
[0139] (5)样品垫的制备
[0140] 样品垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的样品垫处理液浸泡样品垫，样品 处理液的量为100ul/cm2,然后在37°C下Ih烘干，样品垫的组成为：pH为7. 2的IOmMPB缓 冲溶液，含 1%BSA，15%蔗糖，0? 1%Tween-20〇
[0141] 实施例9彩色胶乳BPI-ANCA抗体检测试纸1组装
[0142] 如图1所示的抗BPI-ANCA抗体检测试纸，其中结合垫（2)和分析膜（3)分别为实 施例8制备的结合垫1和分析膜1，其余组分制备步骤同实施例8,各组分烘干后按图1和 图2搭接成大板，烘干后用剪切机根据底板的大小剪切成条，按图1所示组装安装在试纸条 卡壳里。
[0143] 实施例10彩色胶乳BPI-ANCA抗体检测试纸2组装
[0144] 取实施例8制备的结合垫2和分析膜2以及其他组分，各组分烘干后根据底板的 大小剪切成条，按图2所示组装。
[0145] 实施例11彩色胶乳BPI-ANCA抗体检测试纸3组装
[0146] 取实施例8制备的结合垫3和分析膜3及其他组分，烘干后根据底板的大小剪切 成条，按图2所示组装。
[0147] 实施例12彩色胶乳BPI-ANCA抗体检测试纸4组装
[0148] 取实施例8制备的结合垫4、分析膜4及其他组分，烘干后根据底板的大小剪切成 条，按图1所示组装。
[0149] 实施例13样本处理
[0150] 血清样本：取全血1~5mL于血清米集管中，静置30min~2h，3000~5000g离 心5~lOmin，取上清即得。根据试纸条的检测精度，把样本用加样缓冲液稀释0-100倍，取 50-100yL滴加到试纸条的加样孔中，静置5~20分钟后参照图4和图5观察结果。
[0151] 血浆样本：取全血1~5mL于枸橼酸钠或肝素钠抗凝管中混匀，1000~3000g离 心5~lOmin，取上清即得到血浆样本。根据试纸条的检测精度，把样本用加样缓冲液稀释 0-100倍，取50-100yL滴加到试纸条的加样孔中，静置5~20分钟后参照图4和图5观察 结果。
[0152] 全血标本：取指尖或耳垂新鲜血约50yL，滴加到加样孔中，马上用50yL加样缓 冲液滴加到加样孔中稀释，静置5~20分钟后参照图4和图5观察结果。
[0153] 实施例14试纸条性能评估
[0154] 本发明试剂条的性能包括稳定性、批内不精确度和批间不精确度评估。
[0155] 1、37°C加速老化试验
[0156] 将试纸条放置37°C，每日取出用质控品和阴阳性参考品各10份的阴阳性符合率 的批内精密度来判断试纸的稳定性。4个月后质控品以及各个阴阳性参考品的阴阳性符合 率均为100%。推测试纸条的保质期在18个月以上。
[0157] 2、批内不精确度
[0158] 取实施例5~8各一个批次的金标试纸条，和实施例10~12各一个批次的胶乳 试纸条，分别用高、中、低三种阳性血清和阴性血清各一份，每份血清分别用金标试纸条和 胶乳试纸条重复检测10次，结果下表所示，所有阳性血清的检测结果均为阳性，所有阴性 血清的检测结果均为阴性，提示本发明的胶体金试纸条和胶乳试纸条批内不精确度符合标 准。
【主权项】
1. 抗BPI-ANCA抗体免疫层析试纸条，包括样品垫（I)、结合垫（2)、分析膜（3)、吸水垫 (6)、底板（7)、检测带T线⑷和质控带C线（5)，所述底板（7)的上部贴合有分析膜（3)， 所述分析膜（3)上部的两端分别贴合有结合垫（2)和吸水垫（6)，所述结合垫（2)上部的一 端贴合有样品垫（1)，所述检测带T线（4)和质控带C线（5)设置在分析膜（3)上，其特征 在于，BPI-ANCA抗原蛋白结合在结合垫上或包被在检测带上。
2. 根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的结合垫（2)包被胶体 金标记物或胶乳（乳胶）标记物。
3. 根据权利要求1所述的BPI-ANCA抗体检测试纸条，其特征在于，所述的结合垫为1 层（图1)或2层（图2)与分析膜错落搭接。
4.一种BPI-ANCA抗体检测试纸条的制备方法，具体包括如下步骤： 步骤I.BPI-ANCA抗原蛋白的制备 步骤2.结合垫⑵制备 (1) 胶体金标记物的制备：用纳米金溶液标记BPI-ANCA抗原蛋白、抗人IgG抗体、抗人 IgA、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（ProteinG)，以及其他与检测带T线和质控带 C线包被蛋白形成免疫复合物的蛋白。 (2) 胶乳标记物的制备：用带活性基团的胶乳标记BPI-ANCA抗原蛋白、抗人IgG抗体、 抗人IgA抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（ProteinG)，以及其他与检测带T线 和质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。 (3) 结合垫（2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，将步骤（1)制备的胶体金标记 物或胶乳标记物喷涂在玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。 步骤3.分析膜（3)制备 (1) 检测带T线（4)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被蛋白，如结合 垫上的结合蛋白含BPI-ANCA，检测带T线的包被蛋白是抗人IgG或/和IgA。如果结合垫 上含有抗人IgG或/和IgA，检测带T线包被蛋白为BPI-ANCA。需要分别检测BPI-ANCA的 两种抗体时，检测带T线可设置2条（图3)。 (2) 质控带C线（5)制备：根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白，如结合 垫标记蛋白是单一的BPI-ANCA，质控带C线的包被蛋白为抗BPI-ANCA的抗体；如果结合垫 标记蛋白是单一的抗人IgG抗体或/和IgA，质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG或 IgA的抗体；结合垫标记蛋白有2层时，质控带C线的包被蛋白是能与结合垫对应层结合蛋 白形成免疫复合物的蛋白。 步骤4.样品垫制备 将玻璃纤维膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用，或者直接使用。 步骤5.试纸条组装 把步骤1~4所制作完成的材料，按图1或图2搭接，根据底板的规格切割成一定的长 度和宽度，安装在底板和卡壳里。
5. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的BPI-ANCA抗原蛋白是 把全长BPI-ANCA基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆到原核或真核表达载体里， 表达纯化获得。
6. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的BPI-ANCA抗原蛋白是 用多肽合成仪合成含有BPI-ANCA重要抗原表位的BPI-ANCA多肽，并偶联到载体蛋白上而 获得。
7. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗人IgG抗体为鼠源、 兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。
8. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗BPI-ANCA的抗体是 以BPI-ANCA为免疫源产生的抗体。
9. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗人IgG抗体的抗体是 指能与该抗体形成免疫复合物的抗体。
10. -种抗BPI-ANCA抗体检测方法，其特征在于，用权利要求1~9所述的免疫层析试 纸条，对待检样品进行检测，具体步骤包括： (1) 样本处理：取血清、血浆或全血样本； (2) 把样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5~30分钟，观察T线和C线； (3) 结果判读：T线和C线均显现，结果为阳性；T线不显现，C线显现，结果为阴性；其 他情况提不试纸失效。
【专利摘要】本发明公开了一种抗BPI-ANCA抗体检测试纸、制备方法及应用。该试纸条包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6)，结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1)，检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上。本发明采用BPI-ANCA抗原蛋白，实现对样本中抗BPI-ANCA抗体的高灵敏度、高特异性快速检测，为临床炎症性肠病等自体免疫性疾病的辅助诊断提供依据。
【IPC分类】G01N33-558, G01N33-577, G01N33-564
【公开号】CN104764882
【申请号】CN201410412016
【发明人】陈菲, 李振军, 霍如松, 钱洋
【申请人】苏州和锐医药科技有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年8月20日