抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，包含该单克隆抗体的金标试纸条及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体，包含该单克隆抗体的金标试纸条及应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。ALV属于反转录病毒科，禽C型反转录病毒属。根据病毒感染的宿主范围、干扰谱和囊膜抗原，可将ALV进一步区分为A至G七个亚群。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)最早于1988年在英国分离得到。1999年中国首次报道ALV-J的出现，继而中国大部分地区相继出现了 ALV感染的现象。ALV大范围的爆发给我国养禽业带来了很大的经济损失。
[0003]禽白血病目前没有有效的防治措施。预防本病的主要方法是淘汰阳性鸡，选育出无白血病鸡群以净化种群。因此，该病的准确诊断尤为重要。本发明利用原核表达的重组衣壳蛋白(P27蛋白)免疫小鼠，通过杂交瘤技术最终获得2株抗p27蛋白的单克隆抗体，命名为4A2和3H11。并且利用两株单抗研制了检测禽白血病病毒的金标试纸条。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供一种抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体。
[0005]本发明的一种抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆单体由保藏编号为CGMCC N0.11089的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC N0.11090杂交瘤细胞株分泌产生。
[0006]免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒测定两株单抗的的抗体亚型全部是IgGl。单抗特异性鉴定结果表明，IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV 和 REV 与两株单抗反应的OD值均小于0.15，且ALV-J，ALV-A，ALV-B与两株单抗反应的OD值均大于1.2，表明两株单抗具有良好的特异性。
[0007]本发明利用两株单抗研制了检测禽白血病病毒的金标试纸条。用试纸条检测ALV-J，ALV-A, ALV-B, IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV 和 REV等14种常见的禽类病毒。结果试纸条只与ALV-A，ALV-B和ALV-J抗原反应，说明试纸条具有良好的特异性。用试纸条检测细胞培养的ALV病毒及体外表达的不同浓度p27蛋白(150ng/ml, 75ng/ml, 37.5ng/ml, 18.75ng/ml, 9.375ng/ml)纯化的 p27 蛋白，结果试纸条的灵敏度为18.75ng/ml。用试纸条检测不同浓度J亚群病毒(4000，2000，1000，500，250，125，62.5TCID50/ml)，结果试纸条的灵敏度为250TCID50/ml。
[0008]在此基础上，本发明提供了所述的单克隆抗体在制备检测禽白血病病毒的金标试纸条中的应用。及
[0009]所述的单克隆抗体在制备检测禽白血病病毒的试剂盒中的应用。
[0010]含有所述的单克隆抗体的检测禽白血病病毒的金标试纸条也是本发明保护的范围。及
[0011 ] 含有所述的单克隆抗体的检测禽白血病病毒的试剂盒也是本发明保护的范围。
[0012]本发明的目的之二是提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0013]本发明以HB09JY03毒株提取的DNA为基础，通过PCR方法，扩增出p27基因并克隆至PMD-18T载体。测序鉴定正确后，通过双酶切将p27基因亚克隆至原核表达载体pET-30a，构建重组质粒pET-30a-p27并转化BL21感受态细菌。通过诱导表达，最终获得重组p27蛋白，并对该蛋白进行纯化。
[0014]Western blot分析检测结果表明，纯化的p27蛋白能与兔抗天然p27蛋白阳性血清发生反应，表明具有生物反应活性。
[0015]将纯化的p27蛋白作为免疫原，腹腔接种6周龄BALB/c小鼠。按照常规杂交瘤细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用纯化的p27蛋白为筛选抗原，建立间接ELISA方法，最终筛选出2株持续分泌抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，一株抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4A2，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC N0.11089，保藏日期为:2015年7月20日。
[0016]另外一株抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3H11，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC N0.11090，保藏日期为:2015年7月20日。
[0017]进一步的，本发明还提供了所述的杂交瘤细胞株在制备检测禽白血病病毒试剂中的应用。
[0018]本发明取得的有益效果:
[0019]本发明杂交瘤细胞株4A2和3H11能够高效、稳定地分泌抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体对P27蛋白的效价高，特异性好，因此可用于制备检测禽白血病病毒的试剂盒和金标试纸条。本发明提供的抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的制备方法简单，抗体纯化过程简单，效率高，成本低。采用本发明提供的抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体制成的金标试纸条来检测禽白血病病毒，特异性强，操作简单，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简便，易于推广，更适合于即时检测。
【附图说明】
[0020]图1为诱导表达p27蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析结果图；其中，A图为诱导表达P27蛋白的SDS-PAGE分析结果图，M:蛋白Marker(ku) ;1_3:表达并纯化的重组P27蛋白；B图为诱导表达p27蛋白的Western blot分析结果图，1:纯化的p27蛋白，M:低分子量标准蛋白Marker ；
[0021]图2为两株单抗间接荧光免疫反应(IFA)分析结果图；
[0022]图3为金标试纸条检测p27蛋白敏感性试验结果图；
[0023]图4为金标试纸条检测病毒敏感性试验结果图。
【具体实施方式】
[0024]下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0025]实施例1抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的制备及单抗特异性分析
[0026]I材料和方法
[0027]1.1病毒株、细胞和实验动物
[0028]ALV-J(HB09JY03)由哈尔滨兽医研究所分离鉴定。ALV-J(HPRS103，GenBank:Z46390)、ALV-A(RAV-1，GenBank:M19113)和 ALV-B(RAV-2，GenBank:M14902)由英国Pirbright研究所Venugopal Nair教授赠送；DF_1、S/P20细胞由本实验室保存；6周龄BALB/c雌鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
[0029]1.2主要试剂
[0030]大肠杆菌DH5 α和BL21感受态、原核表达载体pET_30a由本实验室保存；pMD_18T载体、IPTG购自宝生物工程(大连)有限公司；PEG-4000、HPR标记的羊抗鼠IgG、羊抗鼠荧光二抗(FITC-1gG)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；HAT、HT购自GibcoBRL ；1640培养基、抗体亚类鉴定试剂盒购自赛默飞公司；蛋白纯化用填充材料购自GE healthcare。
[0031]1.3引物的设计与合成
[0032]根据HB09JY03毒株的序列(潘伟，高玉龙，秦立廷，祁小乐，高宏雷，孙芬芬，王永强，王笑梅.蛋鸡J亚群禽白血病病毒株HB09JY03的分离鉴定及全基因组序列分析.中国兽医科学，2010，40:1110-1114.)，用软件 primer premier 5.0 设? 对引物 Ρ1、Ρ2 用于扩增ρ27基因，是含有BamH I和Sal I酶切位点的一对特异性引物，上游引物Pl:5，CGGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGAC 3’，含有 BamH I 酶切位点。下游引物 P2:5，ACGTCGACCTAGGGCTGGATAGCAGACG 3’，含有 Sal I 酶切位点。
[0033]1.4DNA提取和p27基因的扩增
[0034]将毒株HB09JY03接种到对数期生长DF-1细胞的6孔板上，7d后收集细胞培养板。用DNA提取试剂盒从DF-1细胞冻融液中提取DNA (按照操作说明书进行)。以提取的DNA为模板进行PCR，反应条件为94°C 5min，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，扩增30个循环，最后72 °C延伸7min。扩增产物于I %琼脂糖凝胶电泳分析。
[0035]1.5重组表达载体pET-30a_p27的构建及鉴定
[0036]利用AXYGEN凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接于pMD_18T载体后转化，提取质粒，用BamH I和Sal I双酶切鉴定，鉴定为阳性的重组质粒的命名为pMD_P27并送生物公司测序。利用BamH I和Sal I双酶切质粒pMD_p27和pET_30a，分别回收720bp和4900bp片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化BL21感受态细菌，小量提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定出阳性质粒，命名为pET-30a-p27。
[0037]1.6p27基因在原核表达系统中的表达、纯化及活性检测
[0038]挑取单个含有pET-30a-p27的BL-21细菌菌落加入Kna+(卡那霉素，100 μ g/ml)的LB中，37 °C过夜振摇培养，次日扩大培养至0D600约为0.8，加入IPTG至终浓度0.1mM,于37°C诱导6h，收获细菌。离心后，将菌体用PBS重悬(5(^^^3/11111^)，于4°(:过夜后，超声波温和裂解菌体，离心取上清，12% SDS-PAGE电泳分析。纯化按照文献(汪家政，范明.蛋白质技术手册.北京:科学出版社，2001.)。将纯化的p27蛋白用兔抗天然p27蛋白阳性血清进行Western-blotting分析。
[0039]1.7免疫动物
[0040]将纯化的P27蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化后颈背部皮下免疫小鼠(10ug/只)。两周后，将纯化的p27蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化后对小鼠进行加强免疫。再间隔两周，用二免同样的方法进行第三次免疫。三免后21d，用纯化的p27蛋白(10yg/只)对小鼠进行腹腔注射，3d后，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融入口 ο
[0041]1.8阳性杂交瘤细胞株的建立
[0042]取上述免疫鼠的脾制成