牙鲆神经肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白表达应用技术领域，具体设及一种牙解神经肤及其应用。
【背景技术】
[0002] 脊椎动物青春期的完成W生殖能力的获得为标志，而青春期的启动始于下丘脑脉 冲性促性腺激素释放激素（GnRH)分泌的提高。在鱼类中性腺的发育和成熟受到了下丘 脑-垂体-性腺轴中各种性激素信号的严格控制。作为该轴的关键因子，GnRH通过刺激促 性腺激素（促黄体激素（LH)和卵泡雌激素（FSH))的合成和释放刺激性腺进行配子发生W 及类固醇的合成，完成机体性成熟。
[0003] 自2001年W来，越来越多的研究表明Kissp巧tin/GPR54系统是调节下丘脑GnRH 释放的重要信号。Kisspeptin是一种由kiss基因编码的神经肤类激素，在哺乳动物中可 成熟的内源性片段kissp巧tin54，kissp巧tinl4，kissp巧tinl3，kissp巧tinlO等 形式存在并发挥作用。大量研究表明在脊椎动物，包括人、哺乳动物和鸟类中，外源性的 kisspeptin刺激会促进GnRH的释放。王海莲等人用kisspeptin对雌性大鼠进行皮下注 射，结果表明注射能在明显提前青春期的发生的同时促进各项指标明显上升。在禽类中， 倪迎冬等人用kisspeptin注射蛋鸡种蛋则明显提高蛋鸡的出产蛋率W及公鸡的性成熟提 前。但是运些研究中用到的kisspeptin多是经过公司化学合成的kisspeptinlO短肤，并 且在C末端进行了酷胺化的蛋白修饰。在使用该神经肤进行动物实验时，多采用逐个个体 注射的方法。运对于在群体数量较大的鱼类养殖中进行则可操作性难度较大。目前的报道 中还没有过对神经肤进行体外表达并得到有生物活性的神经肤的案例。因此，如何经济、大 量地获得功能性的kisspeptin神经肤，如何方便地在水产养殖过程使用该神经肤进行人 工控制性成熟将具有重要的意义。
[0004] 鱼类的性腺发育是外部环境和内部神经、内分泌系统协调作用的结果，但养殖条 件下，往往缺少自然状态下环境因子的诱导。化oathna等（2001)曾报道几乎所有的养殖鱼 类都呈现出一些生殖障碍，如雌鱼不能达到卵母细胞最后成熟、排卵和产卵，雄鱼精液少， 粘稠且质量低，究其原因乃是养殖环境条件变化使养殖鱼类性腺的发育受阻。在运种情况 下运用鱼自身生理过程的启动因子对性腺发育进行调控则具有良好的可行性。而且在养殖 条件下，多数鱼类的性成熟需要经历较长时间，在运种情况下人工缩短性成熟所需要的时 间对于节约生产成本、增加经济效益而言具有重要的意义，同时实现对于养殖鱼类的性腺 发育控制具有重要的科研意义。
[0005] 原核表达系统具有培养体系简单、周期短、发酵成本低廉等优点，因此常被用来进 行工程菌株的构建。但是原核表达过程中也经常会遇到表达的蛋白不具备生物学活性的情 况，特别是像一些短肤，在原核表达体系中和标签蛋白形成融合蛋白，标签蛋白的存在可能 会导致短肤被包裹而无法发挥其活性的情况。因此一直W来都鲜有对内分泌神经短肤进行 体外表达的成功报道。因此，如何通过基因功能技术生产出能产生具有活性、有功能的神经 肤工程菌，并通过简单的方式作用，对于水产养殖业W及各种禽畜动物饲养将具有广阔的 前景和生产意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种牙解神经肤，即能在体外重组表达的，有生物活性的小 片段神经肤，及其在控制鱼类性腺发育过程中的应用。
[0007] 本发明首先提供一种牙解神经肤，其氨基酸序列为SEQIDNO: 1 ;
[0008] 编码上述牙解神经肤的基因，其一种核巧酸序列为SEQIDNO:2 ;
[0009] 本发明还提供一种重组表达载体，所述的表达载体中插入了用于重组表达氨基酸 序列为SEQIDNO:1的神经肤的全部或部分片段，
[0010] 本发明的表达载体优选为原核表达载体祀T32a(+);
[0011] 本发明再一个方面提供一种重组宿主菌，是转化/转染有上述重组表达载体的宿 主菌，例如大肠杆菌；
[0012] 获得的产生重组神经肤用于制备饲料添加剂、兽药或医药产品中的任一种。
[0013] 制备的重组宿主菌用于作为提供神经肤的组分添加到饲料中来使用。
[0014] 本发明克隆得到牙解神经肤的编码序列，并建立和筛选出能有效地进行神经肤重 组表达的载体及工程菌，实现了牙解神经肤在原核生物体内的融合表达，与传统的多肤合 成方法及从天然资源提取多肤的方法相比，本发明的制备方法使得神经肤大批量、低成本 的规模化生产成为可能。本发明得到的工程菌可W直接作为饲料添加剂使用，并利用鱼类 自身的肠激酶作用释放神经肤发挥其功能，因此可应用于海洋养殖鱼类、养殖禽畜类的饲 料添加剂和兽药，解决了养殖业长期存在的难W安全有效地人工控制养殖品种性成熟过程 的问题，并W高科技带动了养殖业及养殖饲料工业的行业技术进步。
【附图说明】
[0015] 图1:牙解神经肤重组载体结构示意图。
[0016] 图2牙解神经肤54融合蛋白结构示意图。
[0017] 图3 :牙解神经肤融合蛋白的诱导表达分析结果。
[0018] 图4 :纯化牙解神经肤54刺激细胞后GnRH的变化。
[0019] 图5:饲喂牙解重组神经肤神经肤工程菌后牙解后血浆GnRH的变化。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1牙解神经肤的筛选及序列分析
[0021] 1、牙解神经肤的筛选
[0022] 申请人对本实验室获得的牙解基因组文库数据进行序列分析，探究编码小肤的核 巧酸序列，然后对编码的氨基酸序列进行BLAST比对，从中筛选出感兴趣的神经内分泌系 统相关蛋白。通过筛选我们发现了一个核巧酸，其序列为SEQIDN0:2,可编码氨基酸序列 为SEQIDN0:1的小分子蛋白质，对该含127个氨基酸的蛋白进行bias化分析，发现其与 NCBI中报道的相比，相似性最高为78%。后续根据其表现出的功能将其命名为牙解神经 肤。
[002引实施例2重组表达载体的构建、鉴定W及神经肤的表达
[0024] 重组质粒的构建与鉴定：根据牙解神经肤的cDNA序列（SEQIDNO:2)，利用一对 特异引物P1和P2扩增牙解神经肤的编码序列。在P1引物的5'端引入限制性内切酶位点 化nI和编码肠激酶酶切位点的序列，在P2引物的5'端引入限制性内切酶位点SacI和终 止密码子编码序列TCA，两个引物序列分别为： 阳0巧]P1:GGTACCGACGACGACGACAAGGCAACAGGATCTGTCCTCTCTGC
[0026]P2：GAGCTCTCAAAAGCGAAGGGTTAACGGGTTGTAGTTG；
[0027]PCR反应体积为 25ul，扩增条件：94°C5min;94°C30s，68°C30s，72°C30s共 35 个 循环；72°C7min。PCR产物经琼脂糖电泳检测后，对目标产物片段回收并与PMD19-T载体进 行TA克隆连接，转化Tran巧a并在LB(Amp+)平板培养。经菌落PCR反应挑取克隆，测序 确定阳性克隆并提取质粒。将该质粒与祀T32a(+)质粒均用化nI和SacI双酶切后，分 别回收酶切产物，并进行T4DNA连接酶连接，得到成功导入含有目的基因的牙解神经肤的 载体（图1)。重组蛋白的序列