一种葡萄球菌a蛋白z结构域衍生物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种葡萄球菌蛋白A的衍生物 及其应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,W下简称金葡菌）是医院和社区获得 性感染的主要致病菌之一，能引起人类化賊性感染、皮肤和软组织感染、坏死性肺炎、賊毒 症、菌血症、骨髓炎和必内膜炎等疾病。目前，具备多重抗生素耐药性的金葡菌，给治疗带来 了极大的困难，特别是耐甲氧西林菌株的迅速蔓延使得单纯依靠抗生素治疗金黄色葡萄球 菌引发的相关疾病变得越来越不可靠。免疫治疗方法能够通过激活或增强机体的免疫系 统，与抗生素协同作用，并能降低抗生素所产生的选择压力，延缓耐药菌的产生，有望解决 金葡菌感染送一棘手问题。
[0003] 葡萄球菌A蛋白（简称蛋白A，SPA)主要存在于金葡菌中，大约90%W上的金 葡菌菌株中含有送种成分，是金葡菌的重要毒力因子之一，具备成为良好的金葡菌疫苗 候选组分的潜力。蛋白A功能区高度保守，含有5个串联的高度同源性的E、D、A、B、C 结构域(UhlenM,GussB,NilssonB,etal.Completesequenceofthestaphylococcal geneencoding蛋白A.Ageneevolvedthroughmultipleduplications[J].JBiol 化em. 1984, 259 (3) : 1695-1702)。为提高蛋白A的耐碱能力，与IgG结合力较强的B结构域 残基位点29的Gly被定向诱变成Ala,新结构域被命名为Z(孟照辉，林兵，谢月辉，等.Fc 段受体结合蛋白（SPA-SPG)基因克隆表达及其在IgG纯化中的应用.生物化学与生物物理 进展.2004, 31 (2) : 146-149.)。同时由于IgGFc段与蛋白A存在较强的亲和力，致使其可 与吞瞻细胞竞争，降低机体产生特异性蛋白A抗体，导致病原菌在人体的感染及复发。因而 研究一种与IgG结合力较弱的蛋白A衍生物，对于金葡菌疫苗的开发具重大意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种与IgG结合力较弱的蛋白A衍生物及其用途。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种包含上述蛋白A衍生物的融合蛋白。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种葡萄球菌A蛋白的Z结构域衍生物，其具有结合 IgG的能力，其中：
[0007] (1)所述Z结构域衍生物由Z结构域的氨基酸突变所形成；
[000引 似氏"化《10%，其中Kz"为所述Z结构域衍生物与IgG的结合常数，Kz为Z结 构域与IgG的结合常数；和
[0009] (3)使用所述Z结构域衍生物免疫动物后可诱发所述动物产生针对葡萄球菌A蛋 白的免疫反应。
[0010] 在另一优选例中，所述Kzfy/Kz《1%，较佳地《0.1%，更佳地《0.01%。
[0011] 在另一优选例中，所述Z结构域的氨基酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0012] 在另一优选例中，所述Z结构域中突变的氨基酸数目为1-10个，较佳地为1-5个， 更佳地为1-3个。
[0013] 在另一优选例中，所述突变发生在Z结构域的第13位Phe和/或第14位Tyr。
[0014] 在另一优选例中，所述Z结构域的第13位Phe突变为Gly和/或第14位Tyr突 变为Gly。
[001引在另一优选例中，所述Z结构域衍生物的氨基酸序列如SEQIDNO. :2所示。
[0016] 本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白是如本发明第一方面所 述的Z结构域衍生物与载体蛋白融合所形成的，并且所述融合蛋白能够诱发机体产生针对 葡萄球菌A蛋白的免疫反应。
[0017] 在另一优选例中，所述载体蛋白具有至少一个T细胞表位，并且在所述载体蛋白 的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、替换、和/或插入而引入所述的Z结构域衍生 物。
[0018] 在另一优选例中，所述载体蛋白与所述抗原肤段不是来自同一个蛋白，并且所述 载体蛋白可W增强所述表位肤的免疫原性。
[0019] 在另一优选例中，所述载体蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、霍 乱毒素B亚单位（CTB)、沙口氏菌鞭毛蛋白（Flic)、百日咳毒素（PTX)、破伤风毒素、或上述 蛋白的免疫原性片段（如破伤风毒素的C片段）、轮状病毒VP7、利什曼原虫的热休克蛋白、 空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、血藍蛋白化巧holeLimpet化mo巧anin, KLH)、牛血清白蛋白度ovineSe;rumA化umin，BSA)，鸡卵白蛋白（Ova化umin，OVA)，纤维蛋 白原。
[0020] 在另一优选例中，所述"分子表面氨基酸残基区"包括loop区、beta-tum区、N末 端或C末端。
[0021] 在另一优选例中，所述载体蛋白为DTT。
[0022] 在另一优选例中，所述Z结构域衍生物连接于所述载体蛋白的C末端和/或N末 端形成所述融合蛋白。
[0023] 在另一优选例中，所述Z结构域衍生物和所述载体蛋白之间具有连接肤；优选地， 所述连接肤长度为3-30个氨基酸；更优选地，所述连接肤长度为4-20个氨基酸；最优选 地，所述连接肤长度为7-17个氨基酸。
[0024] 在另一优选例中，所述Z结构域衍生物和所述载体蛋白之间不具有连接肤。
[0025] 在另一优选例中，所述融合蛋白选自：
[002引 （a)具有SEQIDNO. : 20或21所示氨基酸序列的多肤；
[0027] 化）将（a)中多肤经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具 有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肤。
[0028] 本发明的第H方面，提供了一种多核巧酸，所述的多核巧酸编码本发明第一方面 所述的Z结构域衍生物或本发明第二方面所述的融合蛋白。
[0029] 本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第H方面所 述的多核巧酸。
[0030] 本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面 所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第H方面所述的所述的多核巧酸。
[0031] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
[0032] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、010细胞、DC细胞等。
[0033] 本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第一方面 所述的Z结构域衍生物、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第H方面所述的多核巧 酸、本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞，W及药学上可 接受的载体和/或辅料。
[0034] 在另一优选例中，所述的组合物为疫苗。
[0035] 本发明的第走方面，提供了一种疫苗组合物，所述的组合物含有本发明第一方面 所述的Z结构域衍生物、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第H方面所述的多核巧 酸、本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞，W及免疫学上 可接受的载体和/或辅料。
[0036] 在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
[0037] 在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铅、皂巧、quilA、胞壁醜二肤、矿物油或 植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、比-6、比-12、和CpG)。
[0038] 本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的Z结构域衍生物、本发明第二 方面所述的融合蛋白、本发明第H方面所述的多核巧酸、本发明第四方面所述的表达载体 或者本发明第五方面所述的宿主细胞的用途，
[0039] (a)用于制备针对葡萄球菌蛋白A的抗体；和/或化）用于制备治疗与葡萄球菌 感染相关的疾病的药物。
[0040] 在另一优选例中，所述的疾病包括；金黄色葡萄球菌感染所导致的人类化賊性感 染、皮肤和软组织感染、坏死性肺炎、賊毒症、菌血症、骨髓炎和必内膜炎等疾病等。
[0041] 本发明的第九方面，提供了一种治疗方法，给需要的对象施用本发明第一方面所 述的Z结构域衍生物、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第H方面所述的多核巧酸、 本发明第四方面所述的表达载体本发明第六方面所述的所述的药物组合物或本发明第走 方面所述的疫苗组合物。
[0042] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[004引图1显示了人IgG与Z、ZFY蛋白反应的等温量热滴定量曲线。
[0044]图2显示了小鼠抗血清效价测定结果。
[004引 图3显示了Elisa检测对照组F(油'）2与特异性F(油'）2与SPA结合的性能。
【具体实施方式】
[0046] 本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现将与IgG结合力较强的Z结构域中 第13、14位的化e、Tyr两个关键氨基酸残基均突变为Gly，即ZFY衍生物，可使ZFY与IgG结合能降低到-61.68kcal/mol，仅为原相互作用力的10. 69%，并通过PCR突变技术构建了 ZFY蛋白表达体系。同时将ZFY衍生物和载体蛋白DTT偶联，得到了一种方便表达纯化的蛋 白，该蛋白可有效激发免疫系统产生蛋白A抗体。
[0047] 本发明提供了可有效激发免疫系统产生蛋白A抗体的融合蛋白及其应用。所述融 合蛋白包括葡萄球菌A蛋白的Z结构衍生物，所述Z结构衍生物具有；（1)由Z结构域的氨 基酸突变所形成；（2)Kz"/Kz《10%，其中Kz"为所述Z结构域衍生物与IgG的结合常数，Kz 为Z结构域与与IgG的结合常数；和（3)免疫动物后可诱发所述动物产生针对葡萄球菌A 蛋白的免疫反应。
[0048] 本发明的另一目的是提供由包含该融合蛋白的组合物组成的疫苗，所述的组合物 含有本发明所述的Z结构域衍生物、融合蛋白、多核巧酸、表达载体或者宿主细胞，W及免 疫学上可接受的载体和/或辅料。
[0049] 本发明的另一目的是提供一种治疗疾病的方法，尤其用于葡萄球菌引起的疾病。 该方法是通过向患有由葡萄球菌感染引起的疾病的患者给予由包含本发明的融合蛋白的 组合物组成的疫苗，所述疾病选自下组：人类化賊性感染、皮肤和软组织感染、坏死性肺炎、 賊毒症、菌血症、骨髓炎和必内膜炎等。
[0050] 蛋白A结构域Z氨基酸序列为：
[005U VDNKFNKEQQNA四EILHLP化TEEQRAAFIQSL邸DPSQSAELLAEAKKLNDAQAPK(SEQID NO. : 1)
[005引ZFY衍生物氨基酸序列为：
[005引VDNKFNKEQQNA雄EILHLP化TEEQRAAFIQSL邸DPSQSAELLAEAKKLNDAQAPK(SEQID NO. :2)
[0054] 通过PCR突变技术，将Z结构域中第13、14位的化e、Tyr均突变为Gly，即得ZFY 衍生物。
[00财载体蛋白
[0056] 如本文所用，术语"载体蛋白"指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的蛋 白。通常，所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白，例如病原体蛋白，代表性的例子包括 (但并不限于）；病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白等。
[0057] 如本文所用，术语"Z结构域衍生物（肤）"指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白 的一段肤，该表位相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肤段。 通常，Z结构域衍生物指免疫反应拟祀向的肤段，较佳地来源于哺乳动物（如人）蛋白的一 段肤，而不是来自所述载体蛋白。
[0058] 如本文所用，术语.P化专指蛋白质；级结构数据文件，来自Protein化ta B曰nk(WWW.pdb.org)；
[0059] 如本文所用，术语DTT指白喉毒素的跨膜结构域；
[0060] 如本文所用，术语T细胞表位又称为T细胞Z结构域衍生物，是抗原分子经过抗原 呈递细胞中酶解加工产生的一段