一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学技术领域，具体的说是设及一种合成多肤及其应用和抗流感病 毒疫苗。
【背景技术】
[0002] 流感病毒大爆发是迄今为止对人类生产生活影响最大的流行性疾病之一。上世纪 爆发的=次大流感流行，都是由流感病毒引起的，造成了数千万人口死亡，给人类健康和经 济造成了巨大危害和损失。据WHO统计，全球每年约有10亿人感染流感病毒，50-100万人 死于流感。不同流感病毒亚型的划分是基于红细胞凝集素HA和神经氨酸酶的序列，现阶段 在人群中传播的主要流感病毒亚型为甲型H1N1，H3N2W及乙型流感病毒。
[0003] 阻止流感最有效方法就是接种疫苗，现阶段针对流感病毒的上市疫苗主要包括全 病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗，每种疫苗均含有甲1亚型、甲3亚型和乙型3种流 感灭活病毒或抗原组份，但是流感病毒传播广泛，复杂多变，疫苗需要不断更新，且WK)的 预测准确性有限。
[0004] 所W高保守性、特异功能性表位疫苗应运而生，而国内已有的相关流感病毒多肤 疫苗产品专利大多针对臟及126区域，如：申请号〔肥00810232851、〔肥00810071174 ^及 CN200810071174。但针对流感病毒表面蛋白HA的表位疫苗研究不足。 阳0化]HA蛋白是流感病毒表面主要的包膜糖蛋白，在感染细胞过程中，其作用主要表现 为结合宿主细胞受体，介导胞吞作用及膜融合过程。HA是流感病毒主要抗原区并且包含大 多数中和抗体结合位点。并且由于宿主免疫压力的存在，HA是流感病毒免疫逃逸的主要突 变点，其抗原转变也是造成流感病毒大流行的主要原因。早期对HA抗原区域的研究表明， HA抗原区域包含着大量的中和抗体结合位点，而在运之中，针对流感病毒HA1的中和抗体 直接抑制病毒与宿主细胞受体的结合，从而达到抑制病毒对宿主细胞的感染。但由于宿主 体内的免疫压力，HA1通过极高的突变率及糖基化位点来进行免疫逃逸。所W针对HA1的 疫苗保护效果不甚良好。
[0006] 最近，更多的研究者将疫苗的研究重点转移到HA2上。并且已经分离得到了识别HA2颈部区域的多种具有广谱中和活性的抗体。如单克隆抗体CR6261通过结合HA能够中 和groupl内的大多数病毒，包括H1、册、H9、肥，但其对group2无中和作用。单克隆抗体 CR8020能够中和大部分group2病毒，包括能够感染人的册和H7亚型病毒（7-8)。但是， 运些单克隆抗体的获得是从个别愈后患者（或动物）筛选得到，具有很大的偶然性，不具备 重现性，且造价昂贵。另外一个不足就是，运些单克隆抗体属于被动免疫，虽然运种免疫力 效应快，但维持时间短。一般用于治疗，或在特殊情况下用于紧急预防。相对于由机体自身 产生抗体，使机体不再担屯、被病毒感染的主动免疫来说，其仍然略显不足。
[0007] 为了能够解决主动免疫的问题，有研究人员通过模拟HA2全蛋白S维构象来作为 免疫原进行疫苗的制备，然而运种方法并不能保证其百分百保证所合成多肤与HA2S维构 象一致，致使所制成疫苗不具备免疫原性。同时，工作量大、成本高也是该方法的一大弊端。 也有研究人员考虑采用相对低廉和简单的全病毒进行疫苗的制备，但是HA2在天然病毒中 不暴露，利用全病毒作为免疫原诱导的抗体无法识别HA2,通过全病毒无法诱导出针对HA2 的中和抗体。此外，全病毒免疫处理方式极其复杂，成本相对合成肤疫苗也是比较高的。因 此，如何能够针对流感病毒HA2研制出一种广谱、简单有效的合成多肤疫苗是当务之急。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成多肤及其应用和抗流感病毒疫苗，使 所述合成多肤针对流感病毒HA2抗原区，且简单有效，具有高效价、广谱性和保守性，能够 应用于流感疫苗的制备中，特别是针对H3亚型流感病毒。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0010] 一种合成多肤，氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示（W下简称P6)。
[0011] 本发明针对HA2抗原区中的颈部区设计一种新型的具有免疫原性合成多肤，该多 肤只包含15个氨基酸，设计简单成本低廉。经过检测，本发明合成多肤同时具有化2细胞 表位和B细胞表位，表明本发明合成多肤能够促进体液免疫，所诱导抗体具有较高效价。此 夕F，将本发明所述合成多肤与1968-2014年10763株册亚型菌株HA2氨基酸序列比对分析， 本发明所述合成多肤氨基酸序列与对比菌株相比具有高达97%W上的保守性。
[0012] 为了验证本发明合成多肤与HA蛋白的结合活性W及血凝抑制活性，本发明选取 同样针对HA2抗原区中的颈部区且经过比对保守型在97%W上的其他5个合成多肤（W下 简称P1-P5)进行对比检测，其氨基酸序列如SEQIDN0:2-6所示；其中，分别为P1针对HA2 中76-90位氨基酸序列、P2针对HA2中86-100位氨基酸序列、P3针对HA2中96-110位氨 基酸序列、P4针对HA2中106-120位氨基酸序列、P5针对HA2中116-130位氨基酸序列。
[0013] 将6个合成多肤WKLH载体疫苗、多分支肤疫苗或诺如病毒P颗粒载体疫苗的形 式制成具体疫苗进行相关检测。在抗体分型试验中，通过酶联免疫吸附试验巧lisa),检 测各合成多肤免后血清对A/化isbane/10/2007 (H3)HA蛋白的结合活性，结果显示，同时包 含B/Th2细胞表位的本发明合成多肤免疫原免后血清结合活性最高，说明本发明合成多肤 具有高效价，而其余合成多肤极其显著的低于本发明结合活性；同时检测上述合成多肤免 后血清对A/California/04/2009〇nNl)HA蛋白、A/Canada/720/2005〇12N2)HA蛋白、A/ Anhui/1/2005 〇15Nl)HA蛋白、A/Netherlands/219/03 (H7N7)HA蛋白的交叉结合活性，结果 显示，本发明合成多肤对1、2、5、7各亚型病毒HA蛋白交叉结合活性最高，也表明了本发明 合成多肤具有广谱性；此外，通过抗体分型试验，检测出本发明合成多肤免后血清中抗体成 分主要为IgG，表明所设计免疫原成功的促进了体液免疫，运是能够作为主动免疫疫苗的基 础。
[0014] 并且，通过微中和与RT-qPCR联用试验，本发明合成多肤免疫后血清对A/17/ Perth/09/87化3)病毒，A/Wisconsin/67/2005化3)病毒、A/17/Texsa/2012/30(H3)病毒都 具有一定中和活性，再次表明了本发明合成多肤具有高度保守性。
[0015] 在与全病毒免疫的对比试验中，本发明从正反两个方面验证了W全病毒免疫无法 获得针对HA2的抗体，而通过本发明所述合成多肤能够诱导产生针对HA2的抗体。
[0016] 基于上述多种有益效果，本发明提供SEQIDNO: 1所示氨基酸序列的合成多肤在 制备抗流感病毒疫苗中的应用。
[0017] 作为优选，所述流感病毒为HI、肥、册、册或H7亚型流感病毒。
[0018] 本发明还提供一种抗流感病毒多肤疫苗，其包含SEQIDN0:1所示氨基酸序列的 合成多肤。
[0019] 作为优选，所述多肤疫苗为KLH载体疫苗、多分支肤疫苗或诺如病毒P颗粒载体疫 苗。更优选地，所述多分支肤为四分支肤或八分支肤。
[0020] 上述KLH载体疫苗、多分支肤疫苗或诺如病毒P颗粒载体疫苗为本领域常规的疫 苗制剂形式，在获知本发明所述合成多肤后，均可W按照本领域常规方法或经由试剂公司 制备获得。 阳02U 例如，所述KLH载体疫苗的制备方法可参照如下：
[0022] 合成多肤在C-端合成一个切S，将20mgSMCC(运是联接40条多肤的量）溶于 2mlDMF。将0.8mlKLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加lXPBS(pH7. 2)使蛋白终浓度为 15mg/ml。将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mgKLH蛋白体系中，室溫揽拌反应比。用 1L1XPBS肿7. 4)溶液于4°C下透析6小时，除去游离的SMCC。将透析后的KLH蛋白倒 入50ml离屯、管中，通过离屯、管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算 透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2. 5mgKLH-SMCC溶液转移到5ml离屯、管中。 阳02引举例说明：反应前加入KLH蛋白的量为120mg，透析后的KLH蛋白体积为20ml，那 么透析后的KLH蛋白浓度为6mg/ml，应取出2. 5/6 = 417y1KLH-SMCC溶液转移到5ml离 屯、管中。将3.Omg多肤用0.6ml1XPBS(抑7. 2)溶液溶解（运里多称量出0. 5mg多肤是 用来做化ISA检测的，取出100 即可）。
[0024] 检测多肤随交联好的抗原一起寄出，浓度为5mg/ml。用Ellman试剂检测多肤中的 琉基：在96孔板中加入100y1Ellman试剂储备液，再加入10y1多肤溶液，用Nano分光 光度计在^ = 412皿下测其紫外吸收值，如果0D值〉0. 15做下一步；0D值<0. 15并〉0. 05 补加多肤，直至达到要求；0D值<0. 05返回多肤合成步骤重新质控。Ellman试剂是用来检 测游离琉基的，如果检测液显黄色说明多肤的切S的琉基大部分W游离态存在；如果检测 液不显黄色则说明多肤切S中的琉基已经被氧化形成二聚体或多聚体。将多肤液滴加到 KLH-SMCC管中，室溫下用垂直混匀器混匀反应4小时。用Ellman试剂检测多肤中的琉基： 在96孔板中加入100y1Ellman试剂储备液，再加入10y1教练后的多肤溶液，用Nano分 光光度计在^ = 412nm下测定紫外吸收值。0D值<0. 03说明多肤和KLH蛋白交联率已达 到80%W上；孤值〉〇. 03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联。如果Ellman试剂显 黄色说明多肤与KLH蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肤已经全部与 KLH蛋白偶联。
[0025] 所述多分支肤疫苗的制备方法可参照硕±论文《分支肤的合成与蛋白忍片的制 作》中2. 4部分内容。而所述诺如病毒P颗粒载体疫苗，可将诺如病毒P颗粒与编码本发明 合成多肤的基因共同插入原核表达载体PET-28a中，标签为6个化S，转化入表达载体化21 感受态内，经过夜诱导，包涵体溶解，蛋白亲和纯化，蛋白复性，即可获得。
[00%] 由W上技术方案可知，本发明针对HA2抗原区中的颈部区设计一种新型仅包含15 个氨基酸的具有免疫原性的合成多肤，其同时具有T/B细胞表位，能够诱导体液免疫，结合 包括化、肥、册、册、H7在内的多种亚型流感病毒，同时对册亚型各种毒株均具有中和活性， 相比同样针对该抗原区的其他合成多肤，本发明合成多肤活性最高，具有高效价、高保守性 和广谱性，具有作为各亚型流感病毒疫苗的巨大优势。
【附图说明】
[0027]图 1 所示为P1/P2/P3/P4/P5/P6-KLH免后血清对A/化isbane/10/2007 (册)HA蛋 白的结合活性的效价柱形图，纵坐标表示抗体效价；
[0028] 图2所示为P6-KLH免后血清中抗体分型实验紫外吸收光谱柱形图，横坐标中 Pre-sera表示免疫前血清，为对照，Anti-sera表示免疫后血清；
[0029] 图3所示为P1/P2/P3/P4/P5/P6-KLH免后血清对不同亚型流感病毒株HA蛋白的 结合活性紫外吸收光谱柱形图；
[0030] 图4所示为病毒W及本发明合成多肤免疫原免后血清对HA2多肤和全病毒结合活 性的紫外吸收光谱折线图；其中