一种抗流感病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗流感病毒的鸡卵黄抗体，所述鸡卵黄抗体为特异性抗四价流感病毒的鸡卵黄抗体，所述流感病毒包括甲（A）型H1N1、甲（A）型H3N2、乙（B）型（Victoria系）、乙（B）型（Yamagata系）。该鸡卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：1）制备四价流感病毒抗原；2）对母鸡进行免疫；3）收集免疫母鸡产下的免疫鸡蛋；4）从免疫鸡蛋中制取混合抗体原液；5）检测抗体原液效价，配加稳定剂，从而获得抗四价流感病毒的鸡卵黄抗体。本发明可在短时间与四价流感病毒的特异性病原体结合，能够较长时间有效杀灭四价流感病毒，且安全性能较好、无毒副作用，可有效用于人口咽部和鼻咽部粘膜的相应病原体的预防。
【专利说明】
一种抗流感病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物抗体免疫技术领域，具体是指一种抗流感病毒的鸡卵黄抗体及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病 毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，电镜下流感病毒呈球形或椭圆形，直径约为 80~120nm，初次分离出现可见丝状，长短不一。根据病毒核蛋白（NP)和基质蛋白（MA)的抗原 性的不同，可分为甲型、乙型和丙型。甲型流感并根据表面糖蛋白HA和NA的抗原性又存在不 同的亚型，目前共有16个HA亚型(H1-H16)和9个NA亚型(N1-N9)。病毒基因组包括8个分段的 单链负股RNA。其中甲型流感病毒8个基因片段编码10个蛋白，分别是:血凝素(HA)、神经氨 酸酶(NA)、基质蛋白M2和M1、非结构蛋白NS1和NS2、核衣壳蛋白NP、以及3种多聚酶(PB1、PB2 和PA)。流感病毒变异有抗原性变异、温度敏感性变异、宿主范围以及对非特异性抑制物敏 感性等方面的变异，但最主要的是抗原型变异。
[0003] 流感病毒会造成急性上呼吸道感染，主要通过空气飞沫迅速的传播，流感病毒存 在于病人或隐性感染者的呼吸道分泌物中，通过咳嗽、打喷嚏或谈话等方式散播到空气中， 并可存活30分钟，易感者吸入后即可感染，其次接触病人的餐具、玩具或其它物品，也可感 染，传播速度取决于人群的拥挤程度。在世界各地常会有周期性的大流行，尤其容易感染老 人和儿童，全球每年约有300-500万人感染，其中死亡的有10%左右，其中绝大部分是65岁以 上的老人和2岁以下儿童。流感大流行一般较少发生，平均每10-50年发生一次，自16世纪以 来，有文献记载的流感大流行至少有31起。
[0004] 流感可威胁各年龄群体，5~9岁年龄段的儿童感染率最高，但对6~24个月的儿童、 老人以及有高危身体状况的人群如患有心肺疾病、包括糖尿病在内的代谢疾病、肾功能不 全以及处于各种类型免疫抑制状态的病人都容易被流感病毒感染。由于流感可能与其它呼 吸道感染混淆，而且流感最常见的并发症是肺炎，所以患有呼吸道疾病的人往往比较容易 受到流感病毒的侵袭。此外，对孕妇的研究显示，在孕期最初三个月后患病，疾病的严重程 度增加，孕期用药较为谨慎。
[0005] 现在不提倡用抗病毒药物，目前广谱抗流感病毒药物对甲（A)型H1N1、甲（A)型 H3N2、乙（B)型(Victoria系）、乙（B)型(Yamagata系）病原体有一定效果，但同时其副作用较 强，如金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦等都在不同程度上对消化道、呼 吸系统及中枢神经系统等有影响；化学方法对甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型 (Victoria系）、乙（B)型(Yamagata系)病原体具有破坏微生物结构的特性，但对口腔和鼻咽 部黏膜具有刺激作用；物理方法对甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、乙 (B)型(Yamagata系)病原体具有杀灭作用，但对口腔和鼻咽部黏膜有伤害。
[0006] 由于乙（B)型流感病毒Victoria系和Yamagata系每年发病人数基本相当，所以流 感病毒抗体中仅包含一个系别的乙(B)型流感病毒是无法保证人群受到足够保护的，WHO在 推荐流感病毒毒株时也经常面临两难境地。因此，为了保证免疫保护效果，在近年来WHO的 报告中多次提到四价流感，现有3价流感病毒鸡卵黄抗体，对乙（B)型流感病毒另外一个系 的病毒无法产生阻断及预防性保护。
[0007] 同时，在制备卵黄抗体时，尽管免疫鸡为经过挑选、检查和进行了某些疫病的预防 接种的健康产蛋母鸡，仍存在一些鸡源性的细菌或/和病毒混存于鸡蛋从而进入卵黄抗体 中的可能，如大肠杆菌、沙门氏菌、鸡减蛋综合征病毒、鸡禽白血病病毒等，从而影响抗体的 安全性。目前，一些研究选用带有毒性的甲醛、二乙烯胺(BEI)及丙内酯(BPL)作灭活剂， 对卵黄抗体中外源性病毒具有灭活效果，但对卵黄抗体的活性有影响从而影响效应的效 果。目前使用的外源病毒灭活方法添加了具有毒性的物质，即对卵黄抗体生物活性影响明 显，又对人体存在潜在的毒副作用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种起效快、用药量少、疗效好、且无毒副作用的用于人 口咽部和鼻咽部粘膜的相应病原体预防的鸡卵黄抗体。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供该抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法。
[0010] 本发明通过下述技术方案实现:一种抗流感病毒的鸡卵黄抗体，所述鸡卵黄抗体 为特异性抗四价流感病毒的鸡卵黄抗体，所述流感病毒包括甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙 (B)型（Victoria系）、乙（B)型（Yamagata系）。
[0011] 卵黄抗体是禽类对特定抗原在所产生的相应特异性抗体。卵黄抗体是一种天然存 在、无残留、无毒副作用的免疫球蛋白，是抗病毒药物及抗生素的替代品。目前高免卵黄液 广泛应用于一些疾病的紧急预防和治疗。
[0012] 特异性抗四价流感病毒（甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、乙 (B)型(Yamagata系））的鸡卵黄抗体与抗病毒药物作用原理不同，其与病毒表面相应抗原发 生特异性结合，改变了该抗原的状态，封闭了抗原的功能和影响病毒的活性;遮蔽了病毒表 面与组织、细胞结合的受体，阻止病毒粘附于组织、细胞，排斥了病毒在炎症部位的存在。因 此在当今抗病毒药物滥用和广泛的耐药菌株存生的情况下，更显示出特异性抗四价流感病 毒（甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、乙（B)型（Yamagata系））的鸡卵黄抗 体制剂的重要性和可行性。根据上述特异性鸡卵黄抗体的作用原理，用这种特异性抗四价 流感病毒（甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、乙（B)型（Yamagata系））的鸡 卵黄抗体制剂能够有效地治疗由该四价流感病毒引起的高传染性的呼吸道症状，如喉咙 痛、流鼻涕、咳嗽、鼻塞、流眼泪、全身酸痛、软弱无力、畏寒、发热等。
[0013] 上述一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤： (1) 制备四价流感病毒抗原； (2) 对母鸡进行免疫； (3) 收集免疫母鸡产下的免疫鸡蛋； (4) 从免疫鸡蛋中制取混合抗体原液； (5) 检测抗体原液效价，配加稳定剂，从而获得抗四价流感病毒的鸡卵黄抗体。
[0014] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（1)中，制备四价流感病毒抗 原的具体过程为:取甲型、乙型和丙型流行性感冒病毒株，分别接种鸡胚;将接种有不同类 型流行性感冒病毒株的鸡胚进行培养;待鸡胚出现病变时，分别收取病毒液，之后进行病毒 灭活;最后经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心后分别制得四价流感病毒抗原。
[0015] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(2)中，对母鸡进行免疫的过 程包括以下步骤： (2.1) 将制备得到的四价抗原按含量比1:1:1:1混合，加入等体积的弗氏完全佐剂或弗 氏不完全佐剂混合，然后在组织裂解仪上25Hz共振5min，重复2次，制得乳化混合液，经安全 试验、无菌检验及物理性状检验合格后，供产蛋母鸡免疫使用； (2.2) 取健康适龄的产蛋母鸡，取乳化混合液在产蛋母鸡的翅基部三角肌或胸肌等位 置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射;其中首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采 用弗氏不完全佐剂;首次免疫间隔〇、2、4、8周加强免疫，每次免疫剂量为0.5~lml/只。
[0016] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(4)中，从免疫鸡蛋中制取混 合抗体原液的具体过程包括以下步骤： (4.1) 对免疫鸡蛋进行预处理，将预处理后免疫鸡蛋的蛋黄加入纯化水稀释匀浆，，用 lmol/L盐酸溶液调pH4.8~5.5，并在2~8°C的温度条件下静置1~24小时； (4.2) 静置后的液体进行离心，从而去除沉淀物、取上层清液； (4.3) 取上层清液加入硫酸铵溶液盐析，过夜沉淀； (4.4) 离心脱盐，取沉淀得粗提物； (4.5 )加入缓冲液使粗提物复溶，调节pH为4.8~5.5，在2~8 °C的温度环境过夜，取上层 清液； (4.6) 用超滤膜进行超滤； (4.7) 超滤后置与温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时，进行病毒的灭活；； (4.8) 灭活后，取上层清液，即获得混合抗体原液。
[0017] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述制备方法中，进行离心过程的离心 参数为4000~20000r/min。
[0018] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(4.1)中，对免疫鸡蛋进行预 处理的过程为:将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称 取重量，并记录。
[0019] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(4.3)中加入硫酸铵溶液的质 量分数为10%~35%。
[0020] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(4.5)，粗提物复溶采用缓冲 液的溶液为1 /150~1 /300体积弱酸性缓冲液。
[0021] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(4.6)中超滤使用的超滤膜的 截留相对分子量为50~100kD。
[0022] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： (1) 本发明中所述鸡卵黄抗体可在短时间与流感病毒特异性病原体结合，抗体在作用 表面停留时间长，可有效杀灭特异性甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型(Victoria系）、乙 (B)型（Yamagata系）的流感病毒，作用病原体全过程对口咽黏膜无痛无刺激，保护范围更 广； (2) 本发明中所述鸡卵黄抗体局部施于鼻腔、口腔、咽、喉及支气管黏膜，既无全身用药 的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好，不吸收破坏鼻腔、口腔、咽、 喉、支气管内正常菌群的生态环境，也会引起局部菌群失调； (3) 本发明中所述鸡卵黄抗体不激活补体系统，不与类风湿因子产生非特异性结合，不 固定金黄色葡萄球菌A蛋白，不与蛋白G，以及人类细胞FC受体结合，因而不易发生变态反 应； (4) 本发明中所述鸡卵黄抗体的提取物不产生急性毒性反应，属于实际无毒级； (5) 本发明中制备所得的抗四价流感病毒卵黄抗体成品生物学活性稳定，可较长时间 常温保存，每毫升抗四价流感病毒卵黄抗体成品含相应特异病原抗体效价不低于1:32,具 有更多的抗原结合位点，可有效用于人口咽部和鼻咽部粘膜的相应病原体的预防。
[0023] (6)本发明中所述鸡卵黄抗体的制备方法中，采用54~60°C，8~20小时灭活病毒灭 活方式，既保持了卵黄抗体的生物活性，又无其他毒副物质； (7)本发明中所述鸡卵黄抗体的制备方法中，抗体提纯水稀释酸化工艺的使用，盐析过 程硫酸铵的使用，以及离心和超滤等纯化技术的应用，可制备得到纯度不低于80%的高纯度 鸡卵黄抗体。
【具体实施方式】
[0024]为使本发明的目的、工艺条件及优点作用更加清楚明白，结合以下实施实例，对本 发明作进一步详细说明。此处所描述的具体实施实例仅用以解释本发明，并不用于限定本 发明。
[0025] 本发明具体提供了一种能抗甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、 乙(B)型(Yamagata系)流感病毒的鸡卵黄抗体。
[0026]其具体制备方法包括以下步骤： (1) 取甲型、乙型和丙型流行性感冒病毒株，分别接种鸡胚;将接种有不同类型流行性 感冒病毒株的鸡胚进行培养;待鸡胚出现病变时，分别收取病毒液，之后进行病毒灭活;最 后经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心后分别制得四价抗原； (2) 制备得到的四价抗原1:1:1:1混合，加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂 混合，然后在组织裂解仪上25Hz共振5min，重复2次，制得乳化混合液，经安全试验、无菌检 验及物理性状检验合格后，供免疫蛋鸡用;取健康适龄的产蛋母鸡，取乳化混合液在产蛋母 鸡的翅基部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射;其中首次 免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂;首次免疫间隔〇、2、4、8周加强免疫，每 次免疫剂量为0.5~lml/只； (3) 收集免疫母鸡下的免疫鸡蛋， (4) 从免疫鸡蛋中制取混合抗体原液，具体过程包括以下步骤： (4.1) 收集免疫母鸡产下的免疫鸡蛋，将免疫鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋清蛋黄，去除 蛋清，收集蛋黄称取重量;将蛋黄按1:6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用lmol/L盐酸溶液调 pH4.8~5.5，并在2~8°C的温度条件下静置1~24小时； (4.2) 静置后的液体进行4000~20000r/min离心，从而去除沉淀物、取上层清液； (4.3 )将获取的上层清液中加入10%~35%硫酸铵盐析，使其充分混匀，之后过夜沉淀； (4.4)沉淀完成后，进行4000~20000r/min离心脱盐，取得沉淀制得卵黄抗体粗提物，去 除硫酸铵上层清液； (4.5) 获取的卵黄抗体粗提物用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调节pH为4.8~ 5.5，令其充分溶解，并在2~8 °C的温度环境过夜，之后获取上层清液； (4.6) 将获取的上层清液用截留相对分子量50~100kD的超滤膜进行超滤； (4.7) 超滤后置与温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时，进行病毒的灭活； (4.8) 进行灭活后的溶液，取其上层清液，剩余的悬浊液进行4000~20000r/min离心分 离，除去沉淀，获得的上层清液进行合并，获得混合抗体原液； (4)通过上述的方法制备得到的抗菌鸡卵黄复合抗体，通过血凝抑制试验方法检测抗 体效价： 其中，甲型H1N1彡1:32; 甲（A)型 H3N2彡1:32; 乙（13)型（￥;[(31:01^&系）^:1:32; 乙（B)型（Yamagata 系）多 1:32。
[0027]根据混合抗体原液效价，配加稳定剂，从而获得抗四价流感病毒的鸡卵黄抗体。 [0028] 实施例1: 本实施例为验证卵黄抗体灭活病毒性能，进行如下试验： 取稀释后的甲型H1N1型、甲型H3N2型、B型(Victoria系）、B型(Yamagata系)流感病毒悬 液分别与等量待检样品混匀，至常温下作用30min，加入至已长成单层的96孔细胞板中（每 孔含100ur混合液和100ul病毒培养液），置33°CC02培养箱培养48h后，每孔取50ul细胞悬液 与50ul 1%豚鼠红细胞悬液混匀，置室温放置45min观察结果。采用终点稀释法，计算待检产 品对4个型别流感病毒的平均灭活对数值(TCID50)。
[0029] 在室温条件下，经过3次重复实验，待检样品对流感病毒甲型H1N1型、甲型H3N2型、 B型(Victoria系）、B型(Yamagata系）的平均灭活对数值分别为4.43、6.27、6.57、5.87。
[0030] 有试验结果可知，本发明中制备的抗流感病毒鸡卵黄抗体灭活病毒性能较好，能 够较快较好的灭活病毒。
[0031] 实施例2: 本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的抗流感病毒鸡卵黄抗体的在活体生物 不同部位的停留时间长，对获取的抗流感病毒鸡卵黄抗体进行了药物停留时间小动物成像 实验，具体过程如下： 调制缓冲系统(碳酸氢钠缓冲系统)的pH至8.5-10.0，将少量荧光染料加入到抗流感病 毒鸡卵黄抗体溶液中，温度为4°C，垂直混合过夜。然后超滤离心（5000-6000g，离心时间4-6min)来去除未反应的焚光分子。
[0032] 试验方法:将含有荧光分子抗流感病毒鸡卵黄抗体原液制成口腔喷雾。分成三组 实验组:a组:喷雾后禁水8小时，不禁食;b组:喷雾后禁食8小时，不禁水;c组:喷雾后禁水禁 食8小时;皮肤喷涂:背部剔除部分皮毛后进行喷雾。
[0033] 通过小动物成像采集喷雾部位荧光强度，通过荧光强度减弱情况，判断抗流感病 毒鸡卵黄抗体原液在喷雾部位的停留时间，口腔喷雾后，不同组别的抗流感病毒鸡卵黄抗 体原液的荧光随时间减弱，口腔喷雾后，不同试验组别在口腔的停留时间均能达到8.5小 时，其中禁食禁水实验组效果比较好。含有荧光分子的抗流感病毒鸡卵黄抗体原液在皮肤 处停留时间可长达70多小时。
[0034] 实施例3: 本实施例为验证所述的抗流感病毒鸡卵黄抗体在活体生物眼球表面的安全性，对获取 的抗菌鸡卵黄复合抗体进行了急性眼刺激试验，具体过程如下： 取受试物0.1ml滴入家兔右眼结膜囊内，被动闭合4s，30s后用足量、流速较快但又不会 引起动物眼损伤的生理盐水冲洗30s，左眼为空白对照。记录滴眼后lh、24h、48h、72h、7d、 14d和21d的局部反应。如果72h内未出现刺激反应，或第7d、第14d，眼睛刺激反应完全恢复， 即可提前终止试验。试验结果见表一。
[0035] 表一抗流感病毒鸡卵黄抗体对家兔眼刺激试验结果
*平均评分系指24h、48h、72h评分之和除以观察时间段数3。
[0036] 试验结果表明，受试物滴入家兔右眼结膜囊后，3只家兔眼结膜、角膜、虹膜均未见 异常。本发明中所述的抗流感病毒鸡卵黄抗体对家兔急性眼刺激试验结果无刺激性。
[0037] 实施例4: 本实施例为验证所述的抗流感病毒鸡卵黄抗体在生物活体表面的安全性，对获取的抗 菌鸡卵黄复合抗体进行了多次完整皮肤刺激试验，具体如下： 试验前24h，将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围左、右各约3cmX3cm。试验时将受 试物原液0.5ml涂于一侧2.5cm X 2.5cm皮肤上，另一侧皮肤作为空白对照。在涂抹后4h除去 受试物，每天涂抹一次，连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观察结果，对家兔多次完整皮肤刺 激试验结果为无刺激性。
[0038] 受试物涂抹家兔皮肤后，动物皮肤均未出现红斑、水肿炎性反应，平均每天每只动 物刺激反应评分均值为〇，见表二。
[0039] 表二抗流感病毒鸡卵黄抗体对家兔多次完整皮肤刺激试验结果
由上表可知，该样品对家兔多次完整皮肤刺激试验结果为无刺激性。
[0040]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不 脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种抗流感病毒的鸡卵黄抗体，其特征在于，所述鸡卵黄抗体为特异性抗四价流感 病毒的鸡卵黄抗体，所述流感病毒包括甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙(B)型(Victoria系）、 乙（B)型（Yamagata系）。2. 权利要求1所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 制备四价流感病毒抗原； (2) 对母鸡进行免疫； (3) 收集免疫母鸡产下的免疫鸡蛋； (4) 从免疫鸡蛋中制取混合抗体原液； (5) 检测抗体原液效价，配加稳定剂，从而获得抗四价流感病毒的鸡卵黄抗体。3. 根据权利要求2所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步 骤(1)中，制备四价流感病毒抗原的具体过程为:取甲型、乙型和丙型流行性感冒病毒株，分 别接种鸡胚;将接种有不同类型流行性感冒病毒株的鸡胚进行培养;待鸡胚出现病变时，分 别收取病毒液，之后进行病毒灭活;最后经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心后分别制得四价流 感病毒抗原。4. 根据权利要求2或3所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所 述步骤(2)中，对母鸡进行免疫的过程包括以下步骤： (2.1) 将制备得到的四价流感病毒抗原按含量比1:1:1:1混合，加入等体积的弗氏完全 佐剂或弗氏不完全佐剂混合，然后在组织裂解仪上25Hz共振5min，重复2次，制得乳化混合 液，经安全试验、无菌检验及物理性状检验合格后，供产蛋母鸡免疫使用； (2.2) 取健康适龄的产蛋母鸡，取乳化混合液在产蛋母鸡的翅基部三角肌或胸肌等位 置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射;其中首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采 用弗氏不完全佐剂;首次免疫间隔〇、2、4、8周加强免疫，每次免疫剂量为0.5~lml/只。5. 根据权利要求2或3所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所 述步骤(4)中，从免疫鸡蛋中制取混合抗体原液的具体过程包括以下步骤： (4.1) 对免疫鸡蛋进行预处理，将预处理后免疫鸡蛋的蛋黄加入纯化水稀释匀浆，用 lmol/L盐酸溶液调pH4.8~5.5，并在2~8°C的温度条件下静置1~24小时； (4.2) 静置后的液体进行离心，从而去除沉淀物、取上层清液； (4.3 )取上层清液加入硫酸铵溶液盐析，过夜沉淀； (4.4) 离心脱盐，取沉淀得粗提物； (4.5) 加入缓冲液使粗提物复溶，调节pH为4.8~5.5，在2~8°C的温度环境过夜，取上层 清液； (4.6) 用超滤膜进行超滤； (4.7) 超滤后置于温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时，进行病毒的灭活； (4.8) 灭活后，取上层清液，即获得混合抗体原液。6. 根据权利要求5所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于:所述制 备方法中进行离心过程的离心参数为4000~20000r/min。7. 根据权利要求6所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于:所述步 骤(4.1)中，对免疫鸡蛋进行预处理的过程为:将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋 清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量，并记录。8. 根据权利要求6或7所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于:所 述步骤(4.3 )中加入硫酸铵溶液的质量分数为10%~35%。9. 根据权利要求6或7所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于:所 述步骤(4.5)，粗提物复溶采用缓冲液的溶液为1/150~1/300体积弱酸性缓冲液。10. 根据权利要求6或7所述的一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于:所 述步骤(4.6)中超滤使用的超滤膜的截留相对分子量为50~100kD。
【文档编号】C07K1/36GK105968195SQ201610385011
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】林小军, 朱玲, 林烨暄, 万强, 雷雨, 冯梅, 胡方焱, 何珊, 江秀坤, 叶琳
【申请人】成都安蒂康生物科技有限公司