Neoechinuline B的抗流感用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及了 Neoechinuline B的新用途，即其在预防或治疗流感尤其是甲型流 感中的药学用途。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，发病 率高，容易引起爆发流行或大流行。根据其内部核蛋白（NP)和基质蛋白（M)的抗原性不同， 流感病毒可分为A型、B型和C型。A型（又称甲型）流感病毒大规模流行可引起极高的发病 率和死亡率，严重威胁着人类的健康（W. H. 0. 2003 ;Coleman2007)。A型流感病毒在二十世 纪主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2,共造成 约 5000 万人死亡（Kilboume2006 ;Taubenberger，Hultin et &1.2007)。2009 年甲型流感也 是由H1N1 流感病毒引起（Dawood，Jain et al. 2009 ；Zimmer and Burke 2009)，其传播之迅 速，引起了世界的关注。据世界卫生组织统计，每年北半球有超过一亿人感染流感，并且有 30-50万人死于流感，造成的经济损失超过百亿美元。目前，临床上应用的抗流感药物的主 要作用靶点包括血凝素、RNA聚合酶、M2离子通道、核蛋白以及神经氨酸酶，如RNA聚合酶抑 制剂T-705, M2离子通道阻断剂金刚烷胺以及神经氨酸酶抑制剂扎那米韦、奥斯他韦、帕拉 米韦以及达菲等。由于流感病毒表面抗原能经常不断地发生变异，使本来有效的流感病毒 疫苗很快失效。美国疾病预防控制中心抽样调查发现，2008/2009年的H3N2毒株和2009年 大流行H1N1病毒中，100 %的毒株对金刚烷类药物都具有耐药性；99. 6%的季节性H1N1流 感病毒对达菲具有耐药性(http://www. cdc. R〇v/flu/weekly/weeklyarchives2008-2009/ weekly35. htm)。我国人口基数大、密度高，流感的潜在威胁性极高。因此，新型多靶点抗 流感病毒药物的研发，对于保障人民生命安全、提高国民生活质量具有重要的意义。
[0003] Neoechinuline B属于异戊二烯-吲哚二酮哌嗪生物碱，该类生物碱最早发现于 曲霉（Quilicol943)，后人们从 Aspergillus, Penicillium，Eurotium 等属真菌中陆续发 现了数十余个该类生物碱同系物。因具有多种生物活性，包括：抗肿瘤、抗氧化、抗菌，以 及抑制蛋白激酶等活性，异戊二烯-吲哚二酮哌嗪生物碱引起了药物化学工作者的广泛 兴趣。专利发明者通过前期研究，从一株深海真菌Eurotium rubrum固体发酵物中分离 得到了 Neoechinuline B等一系列该类型生物碱，并通过抗流感病毒活性筛选，首次发现 Neoechinuline B具有显著的抗H1N1活性。通过深入作用机制研究，发现Neoechinuline B主要作用于H1N1的HA (血凝素）蛋白，在感染初期阻碍H1N1进入细胞，并能一定程度的 抑制NA (神经氨酸酶），从而发挥抗H1N1功效。实验结果表明，Neoechinuline B具有进一 步开发成新型抗流感药物的潜力。
【发明内容】
[0004] 本发的主要目的在于提供Neoechinuline B及其药学上可接受的盐的新用途，用 于制备药物，所述药物用于预防或治疗流感。
[0005] 本发明通过如下方法评价了化合物抑制流感病毒进入细胞的生物活性：
[0006] 1.细胞病变（CPE)抑制试验。
[0007] 流感病毒感染细胞后会导致细胞病变，使得细胞活力降低。如果药物能够抑制流 感病毒复制，则会降低细胞病变数量，提高细胞活力。具体来说：
[0008] 1)将犬肾上皮细胞（MDCK)以1 : 3的比例传代到白色的96孔板中，在37°C细胞 培养箱中用含10% FBS的DMEM培养基培养24h。
[0009] 2)将流感病毒（A/WSN/33 (H1N1)，感染复数（Μ0Ι) = 1)与一定浓度的待检化合物 加入到100 μ L含有2 μ g/mL TPCK处理的胰酶、1 % FBS的DMEM中，充分混匀。化合物的 阴性对照为1% DMS0(稀释化合物所用的溶剂）。同时设立一组只加各化合物不加病毒实 验组，用来检测化合物对细胞活力的影响。
[0010] 3)将96孔板中的MDCK细胞的培养基吸出，将混合有病毒和化合物的培养基加入 到MDCK细胞中，37°C细胞培养箱中培养48h。每个样品三个复孔。
[0011] 4)用CellTiter-Glo荧光细胞活性检测试剂盒（Cat.G7571，Promega)检测细 胞活力。首先将细胞和CellTiter-Glo检测试剂放于室温环境，待其温度平衡至室温，将 100 μ L/孔的CellTiter-Glo检测试剂加入到细胞的培养上清中，震动2min后，避光静置 lOmin。用仪器 Tecan Infinite M2〇OOPROTM 检测细胞活力。
[0012] 5)EC50的计算方法：首先对化合物进行浓度系列稀释，然后利用上述方法测定 出细胞活力。化合物对细胞病变的保护率=l〇〇X(l_(Test compound-Median Virusl)/ (Median Cells-Median Virus2)).其中Test compound表不只加待检化合物不加病毒组的 细胞活力；Median Virusl表示加了待检化合物和病毒组的细胞活力；Median Cells表示 只加入1 % DMS0组的细胞活力；Median Virus2表示加入1 % DMS0和病毒组的细胞活力。 将化合物浓度和相应的保护率输入到软件Prism，即可计算EC5。。此方法已被广泛应用于抗 病毒药物筛选领域（Noah，Severson et al. 2007)。
[0013] 6)CC5。的计算方法：CellTiter-Glo也可以用来检测化合物对细胞的毒性。首先 对化合物进行浓度系列稀释，然后将其加入到细胞中，方法同2)-4)，但不加入病毒。培养 48h后，测定细胞活力。然后将对照组细胞活力（1 % DMS0)定义为100%，将其他各化合物 组细胞活力标准化，除以对照组1% DMS0的细胞活力，再乘以100%。将化合物的浓度和相 应的标准化的细胞活力输入到软件Prism，即可计算出CC5。。
[0014] 2.噬斑抑制实验。
[0015] 利用噬斑抑制实验进一步印证化合物的抗病毒效果。具体方法如下：
[0016] 1)将MDCK细胞传代到12孔板中，在37°C细胞培养箱中用含10% FBS的DMEM培 养基培养24h。使细胞密度达到0.4X106细胞/孔。用PBS清洗细胞一次。
[0017] 2)将A/WSN/33(H1N1)病毒（100PFU/孔）与系列稀释的化合物混合，稀释液为 2 μ g/mL TPCK处理胰酶的DMEM。将混合液加入MDCK细胞中，置于37°C细胞培养箱中吸附 lh〇
[0018] 3)将病毒液吸出，用PBS清洗细胞三次，除去未吸附的病毒。
[0019] 4)用lmL含有1. 5%低熔点琼脂糖、待检化合物、2 μ g/mL TPCK处理胰酶的无酚红 DMEM覆盖细胞。注意温度不能过高，以免将细胞烫死。
[0020] 5)待4°C琼脂糖凝固后（10_15min)倒置放于在37°C培养箱培养。3-4天后对噬 斑进行计数，计算病毒滴度。如果化合物对病毒有抑制作用，则噬斑数量会减少。
[0021] 3.加药时间点实验。
[0022] 用以分析化合物作用于病毒感染细胞的哪一阶段。具体步骤：
[0023] 1)将MDCK细胞传代到六孔板中，在37°C细胞培养箱中用含10% FBS的DMEM培养 基培养24h。
[0024] 2)将A/WSN/33 (H1N1)病毒（Μ0Ι = 1)稀释到不含血清的DMEM中，感染MDCK细 胞。
[0025] 3)流感病毒从吸附到子代病毒粒子释放，其复制周期约为6_8h。故在以下时间段 将药物加入到细胞培养基中：〇-1〇、〇-2、2-5、5-8或8-10h。
[0026] 4)感染10h后，用冰预冷的PBS清洗细胞一次，用200 μ 1/孔的PIPA裂解液裂解 细胞。用细胞刮将细胞刮下，吸入1.5mL ΕΡ管中，置于冰上15min。以12,000rpm4°C离心 lOmin，将上清液转移到另一个1. 5mL EP管中。
[0027] 5)吸取30 μ 1样品与等体积的2X蛋白上样缓冲液混合，KKTC煮样lOmin。
[0028] 6)将煮好的样品各20 μ L加入到12%的蛋白质凝胶加样孔中，进行SDS-PAGE电 泳。
[0029] 7)用免疫印迹法（Western blotting)检测流感病毒的ΝΡ蛋白的表达水平（以此 来检测病毒在细胞内的复制情况）；同时以细胞蛋白GAPDH作为细胞内参（也可用于验证 药物对细胞的毒性）
[0030] 4.血凝抑制试验
[0031] 此方法用来检测药物是否影响病毒与细胞受体之间的结合。具体方法：
[0032] 1)制备1 % (v/v)的鸡红细胞悬液。选1-2只健康鸡，将血液采集到等量抗凝液中 混匀，置4°C冰箱保存。以800-1000rpm离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白 细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中800rpm离心5分钟， 弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4-5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上 清液。放入4°C冰箱中可保存2-3d。使用时用lmL吸管吸取0. lmL红细胞，然后加入9.9mL 的生理盐水，此即1 %红细胞悬液。
[0033] 2)确定病毒的血凝效价。将WSN流感病毒以2倍梯度做倍比稀释，稀释液为PBS。
[0034] 3)将病毒液与1 %红细胞悬液等体积（各50 μ L)混合加入到V底的96孔板中。 置于微量振荡器上振荡lmin，室温静置孵育30min。
[0035] 4)将反应板倾斜成45°C，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉 淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细