胞铺平孔底，凝成均匀薄层，表 明红细胞被病毒所凝集。在确定流感病毒的血凝效价后，确定合适的病毒使用量。
[0036] 5)将药物、DMS0 (阴性对照）或抗HA的特异性单克隆抗体（阳性对照）与病毒液 混合后加入到细胞混悬液中。观察化合物对红细胞凝集有没有抑制效果。
[0037] 5.表面等离子共振实验（SPR)
[0038] 实验室新购置Biacore T200系统（GE Healthcare)，通过该体系对化合物和HA等 进行结合力和动态动力学，计算出化合物和蛋白之间的结合力及动力学数据，包括Kd，Kon 和KofT研究。具体步骤如下：首先将利用氨基偶联法将重组流感病毒HA蛋白偶联到CM5 芯片上，此实验温度均在25°C下进行。HA最终的偶联量大约在16000RU左右。接下来， 化合物作为分析物以不同的浓度流过芯片，系统缓冲液为PBS-P(10mM磷酸盐缓冲液含有 2. 7mM KC1，137mM NaCl 和 0· 05% Surfactant P20, ρΗ4· 5).对于结合实验，分析物的流速 为30 μ L/min，结合时间60s，解离时间为60s。然后用系统缓冲液清洗，以及用50%的DMSO 进行额外清洗。最后利用 Biacore evaluation software (T200Versionl.0)以 1 : 1结合 的模式进行曲线模拟。
[0039] 6.经氨酸酶（NA)抑制试验
[0040] 神经氨酸酶实验中所用的NA来自WSN病毒粒子。#4-methylumbelliferyl-a-D- N-acetyl neuraminic acid sodium salt hydrate solution (MUNANA)为底物检测神经氨 酸酶的活性。反应体系包括待检化合物、病毒（作为NA的供体）以及20 μ M的4-MUNANA， 反应体系为32. 5mM MES溶液（含有4mM CaC12，pH = 6. 5)，反应在96孔板中进行。在37°C 孵育30min后，加入150 μ L34mM NaOH终止反应，然后读数所需激发光波长360nm，发射波长 460nm〇
【附图说明】
[0041] 图 1. Neoechinuline B 的化学结构式
[0042] 图2. Neoechinuline B的核磁共振氢谱
[0043] 图 3. Neoechinuline B 的质谱
[0044] 图4.噬斑抑制实验
[0045] 图5.加药时间点实验
[0046] 图6.血凝抑制实验
[0047] 图7.病毒融合实验
[0048] 图8. NA酶活性的抑制实验
[0049] 图 9. SPR 实验 具体实施方案：
[0050] 本发明并不局限于上述的具体实施例，下述具体实施例仅是示意性的，并不是限 制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保 护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明保护范围之内。
[0051] 实例 1 :Neoechinuline B 的制备
[0052] 利用固体培养基对Eurotium rubrum进行发酵，固体培养基的制备方法为：将 100mL人工海水与100g小麦加入500mL三角瓶中，静置12h，后于121°C高压湿热灭菌 30min，放凉待用。菌株发酵方法为：在PDA(马铃薯、葡萄糖、琼脂）培养皿上挑取长有新鲜 Eurotium rubrum的琼脂片（1~2cm2)，接种于小麦固体培养基上，培养30瓶，25°C下避光 恒温培养30d，得到发酵产物。
[0053] 发酵产物捣碎后用乙酸乙酯超声萃取3次，每次1. 5h，减压浓缩得粗浸膏 (48. 5g)。浸膏用等比例硅胶（160~200目）拌样，利用减压硅胶柱色谱（200~300目硅 胶，100mmX80mm)以石油醚/丙酮为流动相梯度洗脱。石油醚/丙酮（50 : Ι,ν/v)洗脱三 个柱体积后，用石油醚/丙酮（20 : l，v/v)洗脱五个柱体积。收集第二，第三柱体积洗脱组 分，利用中压柱色谱（〇DS C18,480 mmX45 mm，10 mL/min)，甲醇 / 水 30 : 70 ~100 : 0， v/v)梯度洗脱，纯化得到Neoechinuline B (423. 6mg，纯度> 98% )。实例 2 :Neoechinuline B的抗H1N1作用机制：
[0054] L Neoechinuline B化合物能够有效抑制流感病毒的复制
[0055] 通过CPE抑制试验和嗤斑抑制实验证明Neoechinuline B化合物对流感病毒有着 明显的抑制作用，强于阳性药物达菲。CPE抑制试验表明Neoechinuline B化合物的对流 感病毒的EC5。为27. 4 μ M，而阳性药物达菲（磷酸奥司他韦，0SV-P)的EC5。为46. 5 μ M，利 巴韦林（RBV)的EC5。为42. 7 μ Μ(见表1)。噬斑抑制实验表明Neoechinuline Β对流感病 毒的IC5。为7μΜ，而阳性药物达菲（磷酸奥司他韦，0SV-P)的IC5。约为15μΜ(见图4、表 2)。而Neoechinuline Β化合物在MDCK、!fepG2以及Hela细胞中的CC5。均大于100μΜ，说 明Neoechinuline Β化合物的细胞毒性很小。
[0056] 表1. Neoechinuline B化合物抑制流感病毒（WSN)的活性及其细胞毒性分析。
[0058] CC5。：半数细胞毒性浓度；EC5。：半数有效浓度，即抑制一半细胞病变的化合物浓 度。
[0059] 利用细胞病变（CPE)抑制实验计算Neoechinuline B化合物的EC50比利巴韦林 和磷酸奥司他韦抗病毒EC5。小，说明Neoechinuline B化合物抗流感病毒效果明显优于利 巴韦林和磷酸奥司他韦。
[0060] 表2.嗤斑抑制实验证明Neoechinuline B对于流感病毒有明显的抑制作用
[0062] 结果显示：流感病毒在MDCK细胞上可形成病毒噬斑，Neoechinuline B在低 于10μ Μ浓度时即可抑制一半以上的噬斑数量，IC5。约为7μ Μ ;而达菲（磷酸奥司他韦， 0SV-P)的IC5。约为15 μ Μ，说明Neoechinuline Β的抗流感效果明显优于阳性药物达菲。
[0063] 2. Neoechinuline B化合物能够抑制流感病毒进入细胞
[0064] 通过上述加药时间点实验可以初步断定，Neoechinuline B作用于病毒进入细胞 过程。（见图5)
[0065] 结果显示，在全程给药（0-10h)以及0-2h加药均能够有效地抑制流感病毒的复 制。说明药物在病毒感染后〇-2h内发挥抑制作用，而在感染2h之后加药则无明显抑制效 果。实验表明Neoechinuline B作用于病毒与细胞结合阶段。
[0066] 3. Neoechinuline B化合物可以抑制流感病毒与宿主细胞间的吸附
[0067] 为了进一步揭示Neoechinuline B作用的详细机理，采用了血凝抑制试验来检测 化合物是否抑制病毒与细胞的结合。实验结果如图6显示，Neoechinuline B能够有效地 抑制流感病毒产生的红细胞凝聚现象，即说明Neoechinuline B抑制了病毒和细胞的吸附。
[0068] 为了检验Neoechinuline B是否抑制病毒的融合作用，采用了病毒融合实验。实 验结果如图7表明，100 μ Μ的Neoechinuline B对于流感病毒HA引起的融合无抑制作用。 这说明Neoechinuline B对于病毒与细胞的吸附有抑制作用，而对病毒与细胞的融合无抑 制效果。
[0069] 4. Neoeehinuline B可以与流感病毒的HA蛋白结合
[0070] 鉴于Neoechinuline B能够抑制流感病毒与细胞的吸附，猜测可能化合物会结合 到病毒的囊膜蛋白（HA或NA)上。根据文献报道，流感病毒的两种表面囊膜蛋白-HA和 NA，对于病毒进入细胞都发挥了重要的作用。为了明确化合物作用于哪一个蛋白，首先检 测了一下化合物对于NA酶活性的影响。先将化合物和WSN病毒共孵育，然后利用底物检 测化合物对NA酶活性的抑制效果。底物为4-methylumbelliferyl-a-D-N-acetylneurami nic acid sodium salt hydrate solution(MUNANA)。实验结果如图 8 所不，当高浓度时， Neoechinuline B处理组ΝΑ的酶活性受到了一定的抑制，而阳性药物组（达菲）则对流感 病毒ΝΑ酶活性有明显的抑制作用。这说明，Neoechinuline Β对ΝΑ有一定的抑制作用，但 是其抗流感病毒活性的发挥并不主要是通过此机制实现的。
[0071] 利用SPR的方法检测了一下化合物是否能够直接与HA蛋白发生结合。首先，将重 组HA蛋白偶联到CM5芯片上，然后让化合物作为分析物流过芯片。用Biacore T200检测 结合信号。如图9所示，Neoechinuline B能很好的与HA蛋白结合，结合常数kD值大约在 10μΜ左右。相反，利巴韦林（RBV)则不能结合到HA上（数据未展示）。这些数据说明，流 感病毒的ΗΑ蛋白能够与待检化合物以特异性的方式结合。即ΗΑ为Neoechinuline Β的靶 分子，Neoechinuline B通过与HA结合抑制了 HA介导的流感病毒粒子与宿主细胞的吸附， 从而抑制了病毒进入宿主细胞。
【主权项】
1.NeoechinulineB及其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备药物，所述 药物用于预防或治疗流感。
【专利摘要】本发明公开了Neoechinuline？B在制备用于预防或治疗流感药物中的新用途。
【IPC分类】A61P31/16, A61K31/496
【公开号】CN105287580
【申请号】CN201410289156
【发明人】陈雪晴, 司龙龙, 林文翰, 周德敏, 邵宗泽, 刘 东, 牛四文
【申请人】北京大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年6月23日