一种抗流感病毒的单链抗体及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种抗流感病毒的单链抗体及其制备方法和应用的制作方法
一种抗流感病毒的单链抗体及其制备方法和应用技术领域
本发明属于生物工程领域。本发明涉及一种抗Hmi流感病毒的单链抗体^Fv及其制备方法和应用，以及编码该单链抗体的基因，含有该基因的载体和宿主细胞等。
背景技术：
A型流感病毒能感染除人类以外的各种禽类、哺乳类动物如猪、马及海生哺乳动物等，引起急性呼吸道传染病，其流行极大地危害人类健康并对世界经济造成巨大损失， 是难以根治的群发性疾病之一。根据血凝素蛋白(HemagglutinimHA)和神经氨酸酶 (Neuraminidase, ΝΑ)蛋白抗原性的差异，至今为止分别已鉴定出16种亚型和9种亚型。 目前全世界各地相继从猪只上分离到至少有Η1Ν1、Η1Ν2、Η1Ν7、Η2Ν3、Η3Ν2、Η4Ν6、Η5Ν1、 Η9Ν2等数十种不同血清亚型的流感病毒，其中与表现临床症状联系最为紧密的又是Hmi 禾口 Η3Ν2。
2009年3月，首发于墨西哥的甲型Hmi流感在短期内迅速蔓延至全球，截止2010 年8月，包括我国在内全球有214个国家和地区报告发现“甲型Hmi流感”，确诊病例至少有18449人死亡，大有引发全球流感大流行之势，对世界经济及社会稳定造成了巨大的影响，抗体及相关试剂的研究对流感的诊断和预防有非常重要公共卫生学意义。虽然流感病毒亚型众多，但其NP相对保守，研究表明，不同宿主分离的病毒株发现，NP基因相当保守， 氨基酸差别最多不超过11 %，具有型和种属的特异性，是流感病毒型的分类和诊断的基础， 也是研究病毒免疫学反应及研制疫苗的重要对象。M基因编码蛋白中的Μ2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化跨膜蛋白，而Μ2蛋白的膜外区氨基酸序列(第1 25位)高度保守，且Μ2蛋白的抗血清有抑制流感病毒复制的功能，此外病毒血凝素与病毒侵入宿主细胞相关，它的抗体能中和病毒的感染性，可见将流感病毒抗体基因作为抗病基因理论上是可行的。寻找病毒的这些蛋白对应的抗体基因，用来预防、控制和治愈流感病毒的感染，而这些需要快速而高效地筛选到表达特异性抗体及其基因的平台-噬菌体抗体库技术。
此外，克隆抗体的可变区基因并将其导入动物受精卵进行种系转化，培育含该种基因的转基因动物，将为抗病毒感染育种提供又一条新途径。国外已有转抗体的可变区基因的抗病转基因鼠的报道。国内还未见类似研究报道，但利用噬菌体抗体库技术快速获得抗病毒单链抗体的基因早已变为现实，动物转基因技术也处在发展和完善中。只要将两种技术有机结合起来，有望获得抗体的可变区基因的抗病毒育种动物。
另外在免疫治疗方法中，因抗体的种间异源性及分子量过大，可造成宿主的防御性反应，而单链抗体^Fv则可以避免上述治疗难题JcFv是具有完全抗体结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的1/6，具有以下优点(1)保持了抗体的特异性，大大减少了免疫原性；(2)组织穿透力强，分子量小，易进入靶标实体的微循环，且体内清除也较快；(3) 无FC段，可作为导向载体，以酶或细胞因子及药物连接构建双功能抗体，利于治疗与诊断； (4)易于基因操作和基因工程的大量生产；(5)可在多种不同的原核、真核表达系统中表达，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物细胞等表达系统。因此，抗猪流感噬菌体单链抗体技术具有重大的理论意义和应用价值。
目前关于流感病毒单链抗体kFv的研究国内未见报道，相关专利的申请国内外亦未见报道。发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是提供抗流感病毒的单链抗体及其制备方法和应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下
本发明的技术方案之一是一种抗流感病毒的单链抗体，其是下列蛋白质之一
1)由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头肽连接而成的单链抗体，其中轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 所示；
2)如1)所述的单链抗体经过改造得到的衍生抗体，所述的改造包括氨基酸的缺失、取代或插入，并且该衍生抗体具有抗流感病毒的抗体活性。
其中，所述的接头肽可以是常规的。优选的，所述的接头肽是15-20个氨基酸缩合而成的短肽。更优选的，其氨基酸序列是GGGGSGGGGSGGGGS。该15个氨基酸的柔性链接将抗体重链可变区和轻链可变区连接构成单链抗体。
本发明的技术方案之二是编码所述的抗体的基因。
优选的，所述的基因是下述基因之一
1)该基因编码抗体轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示；
2)在严谨条件下该基因编码抗体轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别可与SEQ ID NO. 3和SEQ ID N0. 4限定的DNA序列杂交，且该基因编码的蛋白质具有抗流感病毒的抗体活性。
本发明的技术方案之三是含有所述基因的表达载体。
其中，所述的表达载体可以为本领域常规的各种载体，只要能在宿主内复制和稳定表达，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、 标记基因和翻译调控元件。如市售的质粒(大肠杆菌中合适载体有PLG338、pACYC184、 pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、pHS2、pMBL 等)、粘粒(pHZ132)、噬菌体或病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等所述质粒代表一小部分的可能质粒，其他质粒为技术人员公知。优选pET28a质粒。可以采用本领域熟知的方法构建含有所述抗流感病毒的单链抗体的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等。所述抗流感病毒的单链抗体的基因可以有效连接到表达载体的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述的启动子可以是常规已知的各种启动子，只要能在宿主细胞中发挥启动子的功能即可。如大肠杆菌的Iac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒重磅表达的启动子。所述表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，所述的表达咋提还可以包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白(GFP)基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。
本发明的技术方案之四是含有所述表达载体的宿主。
所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS,293细胞或Bowes和色素瘤细胞等动物细胞。所述的宿主细胞优选大肠杆菌。
本发明的技术方案之五是一种制备所述的抗Hmi流感病毒的单链抗体的方法， 包括将所述的表达载体转化、转导或转染宿主细胞，培养宿主细胞，从培养物中分离蛋白， 得到抗Hmi流感病毒单链抗体。
可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进行分离纯化。
培养基和培养条件均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
重组蛋白的分离纯化方法也可以采用本领域常规的重组蛋白的分离方法，表达的蛋白为包涵体时，还包括对包涵体复性的步骤。
本发明的技术方案之六是所述的抗体在制备抗流感药物中的应用。
扩增本发明单链抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下
本发明的单链抗体是鼠源性的，能够抗Hmi流感病毒、具有中和活性。分子量约为27kD。融合表达时，加上融合表达的标签蛋白(6kD)分子量一共约33KD。本发明的单链抗体能够特异识别Hmi流感病毒，而且能够阻断病毒与天然血清的结合。
本发明单链抗体基因可制备获得双价或多价单链抗体、细胞内抗体及其他小分子抗体，或者作为靶向运载工具。
本发明单链抗体能用来诊断、预防、控制和治愈Hmi流感病毒的感染，或者用于抗病毒的转基因动物育种，用于制备相关的药物或试剂。


以下结合

本发明的特征和有益效果。
图1显示SIVHLl单链抗体的核苷酸序列和氨基酸序列，在重链可变区和轻链可变区序列之间是所述的柔性接头。
图2显示SIVHLl的重链可变区VH的核苷酸序列和氨基酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序列，在氨基酸序列下划线的是所述VH-⑶Rl、VH-⑶R2和VH-⑶R3。
图3显示SIVHLl的轻链可变区VL的核昔酸序列，在该核昔酸序列下是预期的氨基酸序列。在氨基酸序列下划线的是所述VL-⑶Rl、VL-⑶R2和VL-⑶R3。
图4为PCR扩增的抗体重、轻链可变区基因的琼脂糖电泳图。M :2000bpDNAmarker ； 1，2 轻链可变区VL基因扩增产物；3，4 重链可变区VH基因扩增产物。
图5为单链抗体ScFv基因的PCR产物电泳图。M :2000bp DNA marker ；1,2, 3,4 SOE PCR组装的scFv片段。
图6为载体pCANTAB5E-kFv结构示意图及多克隆位点。
图7显示单链抗体多样性的分析。
图8 SIVHLl-pET28a(+)重组质粒酶切鉴定凝胶电泳图。Ml :15000bp DNA分子质量标准；M2 :2000bp DNA分子质量标准；1，2为重组质粒pET28a (+)-SIVHLl的双酶切鉴定。
图9其中a是SIVHLl重链VH的三维结构图，b是轻链VL的三维结构图，c是SIVHLl 全长的三维结构图。
图10左图是可溶性的SIVHLl-Histag重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图，描述表达的SIVHLl经过重折叠纯化的结果，右图是利用WesternBlot方法鉴定分离纯化得到的 SIVHLl。M1, M2为蛋白分子量Marker ；1和2，纯化的SIVHLl-Histag重组蛋白，3和4，空白对照；5,6为抗Histag抗体检测SIVHLl-Histag蛋白。
图11是一曲线图，描述不同浓度单链抗体SIVHLl与A/PR/8/Hmi流感病毒特异性结合的间接ELISA实验结果。
图12是一曲线图，描述不同浓度单链抗体SIVHLl与两株国内分离的A型Hmi流感病毒特异性结合的ELISA实验结果。
具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究，获得了一株抗A型Hmi流感病毒的单链抗体。 单链抗体免疫原性小，组织穿透力强，易进入靶标，非常有利于生产操作。本发明提供的单链抗体具有流感病毒的中和活性，能够阻断流感病毒与血清的结合，对Hmi流感病毒具有特异性亲和力。本发明也提供了该单链抗体的制备方法和应用。
本发明人通过构建噬菌体展示单链抗体库，通过“富集一洗脱一富集”的循环操作，从中筛选得到该单链抗体。进而本发明人分析获得了该单链抗体的基因，并将该基因用于重组载体中，构建了表达该单链抗体的基因工程菌，从而可以大量简单的采用生物工程的方法制备该单链抗体，从而完成了本发明。
噬菌体展示单链抗体库的构建、筛选
(1)设计和合成的小鼠抗体轻、重链混合引物，利用引物从Hmi流感病毒感染的小鼠脾细胞基因中经PCR扩增获得其轻、重链可变区基因片段，通过寡核苷酸链(Linker) 将所述两片段连接，构建出单链抗体基因片段；
(2)经重叠延伸PCR(SOE-PCR)，通过柔性多肽Linker接头(GlyJer)按 VH-Linker-VL方式将VH基因和VL基因随机拼接成kFv基因片段。将kFv基因和pCANTAB 5E载体分别双酶切(sfil和NotI)后连接，转化宿主菌TG1，涂布SOB-AG平板，30°C培养过夜。挑取多个单菌落培养并提取重组质粒，利用表达载体PCANTAB5E上的通用引物进行PCR 鉴定并测序，以此确定抗体的多样性。
其中扩增单链抗体重链VH的引物为
VHa 5-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCC ATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3 ；
VHb :5-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC TGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。
扩增单链抗体轻链VL的引物为
VLc 5-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATYGAGCTCACYCAGTCTCC-3
VLd :5-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。
其中抗体重链可变区具有如图2所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
其中抗体轻链可变区具有如图3所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
(3)重组噬菌粒转化琥珀抑制型大肠杆菌TG1，经过辅助噬菌体M1I07拯救，构建噬菌体单链抗体库。以Hmi流感病毒为抗原包被免疫管，经过3轮的亲和富集筛选，通过 Phage-ELISA鉴定阳性重组抗体，对阳性克隆噬菌体进行测序，获得对应的基因。并用病毒阻断ELISA和夹心ELISA所筛选获得的阳性克隆噬菌体kFv活性进行测定。
(4)将筛选获得的阳性抗体基因与与蛋白表达载体pETj8a-c(+)分别酶切并连接，转化至非琥珀抑制型大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达，对以包涵体形式表达的单链抗体进行重折叠复性，从而获得抗猪流感的可溶性单链抗体，该可溶性单链抗体是目的单链抗体基因片段与表达载体上的His-tag标签融合表达的产物，以该单链抗体为一抗，以抗His-tag抗体为二抗，采用间接ELISA技术检测目的单链抗体，证实该单链抗体可特异性识别Hmi流感病毒。
抗流感病毒的单链抗体
本发明提供的抗Hmi流感病毒的单链抗体，1)是由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头肽连接而成的单链抗体，其中轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。而其中的接头肽是常规的，即常规的单链抗体中连接抗体重链可变区和轻链可变区的接头肽都可以在本发明中使用，优选的是15-20个氨基酸缩合而成的短肽，最佳的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，其是15个氨基酸的柔性链接。
本发明的一最佳实施例为抗Hmi流感病毒的单链抗体(SIVHLl)，全长732个核苷酸，有244个氨基酸(图1)。具有122个氨基酸的重链可变区(图幻和107个氨基酸的轻链可变区(图幻，通过15个氨基酸的柔性链接(GGGGSGGGGSGGGGS)。
本发明提供的单链抗体具有Hmi流感病毒的中和活性，能够阻断流感病毒与血清的结合，对Hmi流感病毒具有特异性亲和力。
本发明提供的抗流感病毒的单链抗体也可以是2、如1)所述的单链抗体经过改造得到的衍生抗体，所述的改造包括氨基酸的缺失、取代或插入，并且该衍生抗体具有抗流感病毒的抗体活性。其中，缺失、取代或插入的氨基酸的数量是一到几个。所述的“几个”是指二个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个外分泌信号肽或者表达序列标签的融合蛋白，只要该融合蛋白还是具有抗流感病毒的抗体活性，都在本发明的保护范围之内。 本发明的一较佳实例是所述的单链抗体和His-tag的融合蛋白，其中，His-tag由多个如6 个His氨基酸组成。也就是说本发明发现只要由1)衍生的蛋白质抗流感病毒的抗体活性， 且衍生方式如上所述，则都可以达到本发明的发明目的。所述的单链抗体可以从重组表达该单链抗体的表达子中分离获得，也可以人工合成获得。
根据本发明，在如SEQ ID No. 1或2所示氨基酸序列中进行1_3个氨基酸残基的突变，也可获得上述衍生抗体，但仍然保持抗流感病毒的抗体活性。
本发明中，术语“单链抗体”，又称kFv，是在DNA水平将抗体重链可变区基因和轻链可变区基因用一段适当的寡聚核昔酸(接头)连起来，使之表达成为一条单一的肤链。 ^Fv分子量小，结构简单，是具有完整抗原结合位点的最小抗体片段。
天然抗体包括重链(H链)和轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结。重链和轻链都分为恒定区和可变区。可变区位于"Y"的两臂末端。其中包括 Fab (antigen-binding fragment，抗原结合片段)，决定了该抗体结合抗原的特异性。“Y“ 的柄部称FC(crystalline fragment,结晶片段)，糖结合在FC上。而单链抗体仅仅包括重链可变区基因和轻链可变区，不包括恒定区，也不包括FC，分子量大大减小。单链抗体更易于进行表达和在基因水平进行改造。易于在多种表达系统中如原核细胞、酵母、植物昆虫及哺乳类细胞中表达，从而可以大量生产且成本低。异源性低、穿透性强、廓清快。不含有Fc 段、不与Fc受体结合，可减少因广泛分布的Fc受体而带来的不利影响，因而具有广泛的应用前景。可用作导向载体对临床某些疾病进行显像定位诊断和导向治疗，中和病毒和毒素， 细胞内免疫及免疫检测等方面。
本发明的单链抗体的重链可变区和轻链可变区包括的互补决定区⑶R1、⑶R2和 ⑶R3的序列见图2禾口 3。
单链抗体的编码基因
本发明的单链抗体或衍生抗体的编码基因是常规的各种编码所述氨基酸序列的基因，只要该基因翻译出来的氨基酸序列是本发明的单链抗体或衍生抗体。如本领域技术人员所知，抗体重链可变区和轻链可变区可以是编码序列表中SEQ ID No. 1(或NoJ)所示氨基酸序列的其他任何碱基序列。例如，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No. 1(或2)的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.3(或4)。而其中，一较佳实例是编码抗体轻链可变区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示；编码抗体重链可变区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示。
本发明也可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4 的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。多聚核苷酸的同系物也指启动子突变体。在所述的碱基序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平，例如对本发明有利的调节序列可来自于革兰氏阴性菌的启动子中，如cos、tac、 trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6 等；或存在于革兰氏阳性启动子amy和SP02中；或来自于真菌或酵母启动子ADC1、AC、P_60、CYC1、GAPDH、TEF、rp^、ADH 等；或者来自Hansenula的丙酮酸脱羧酶启动子或人工启动子等。
本发明的单链抗体或衍生抗体的编码基因也可以是在严谨条件下其抗体轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别可与SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4限定的DNA序列杂交，且该基因编码的蛋白质具有抗Hmi流感病毒的抗体活性。其中，在严谨条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0. Iwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2 8XSSC。20XSSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50 70°C。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6XSSC+0. Iwt % SDS溶液，更优选为5XSSC+0. Iwt %SDS0当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
含有单链抗体基因的表达载体
本发明所述的重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明的单链抗体基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒 (大肠杆菌中合适载体有 pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、 pHS2、pMBL等)、粘粒(pHZ13》、噬菌体或病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等所述质粒代表一小部分的可能质粒，其他质粒为技术人员公知。本发明所述重组载体较佳地采用pET28a质粒。
含有单链抗体表达载体的宿主
本发明所述所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E. coli) DH5ci。将本发明前述重组表达质粒通过常规转化方法，转化至E. coli BL2KDE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。
单链抗体的制备方法
技术领域：
本发明制备所述的抗流感病毒的单链抗体的方法可以是人工合成，可参见各种文献，如多肽的液相合成或者固相合成等。也可以是利用生物工程的方法，制备表达本发明的单链抗体的表达子，从表达子中生产制备得到。包括将所述的表达载体转化、转导或转染宿主细胞，培养宿主细胞，从培养物中分离蛋白，得到抗流感病毒单链抗体。其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，本发明可通过将本发明的重组表达子转化至宿主微生物得到。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的腈水解酶的培养基，优选LB培养基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl IOg/ L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和培养条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生本发明所述的单链抗体即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法将本发明涉及的的重组大肠杆菌(优选E. coli BL2KDE3)重组表达转化体接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD6tltl达到0. 5-0. 7时，在终浓度为 0. 1-l.Ommol/L(优选0. 5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的单链抗体。目的蛋白主要以包涵体形式表达，对包涵体蛋白进行复性并纯化。
单链抗体的应用
本发明的单链抗体是鼠源性的，能够抗流感病毒、具有中和活性。分子量约为 27kD。融合表达时，加上融合表达的标签蛋白(6kD)分子量一共约33KD。本发明的单链抗体能够特异识别Hmi流感病毒，而且能够阻断病毒与天然血清的结合。可用于制备防治猪流感病的产品，能用来预防、控制和治愈Hmi流感病毒的感染，或者用于抗病毒的转基因动物育种，用于制备相关的药物或试剂，及用于猪流感相关的诊断性研究、治疗性研究。
将两个或两个以上的scFv连接成具有多个抗原结合位点的多价scFv，在结构、功能上更接近亲本抗体，与抗原结合比单价scFv更敏感，亲和力更高，几乎与亲本抗体的抗原结合功能一致。本发明单链抗体基因可制备获得双价或多价单链抗体、细胞内抗体及其他小分子抗体，或者作为靶向运载工具。
在抗流感药物中，活性成分之一为本发明所述的抗Hmi流感病毒的单链抗体或衍生抗体。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、吸收促进剂或吸附载体等。该药物可以制成注射剂、片剂、粉剂、胶囊、口服液等多种形式。按照药物领域的常规方法制备。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
实施例1免疫小鼠脾细胞的总RNA的提取并逆转录合成互补DNA
1. 1 A/PR/8/H1N1流感病毒感染小鼠的脾细胞的总RNA的提取
取抗原流感病毒(流感病毒PR8 (A/Puerto-ico/8/34 (HlNl)，为实验室常用病毒， 其生物学特性能代表Hmi流感病毒特点。(吕翠霞等，清营解表合剂对感染流感病毒A/ PR/8/H1N1模型小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响，山东中医药大学学报，第34卷第5期，2010 年9月，第457-458页。)培养上清，将该病毒液接种于MDCK细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)，48h后吸取细胞上清，此即为含有病毒的细胞培养上清液，经测定病毒效价为1 X 105TCID50/mL,放_70°C低温冰箱保存备用。
A/PR/8/H1N1流感病毒细胞培养液上清稀释100倍，采用滴鼻免疫感染Balb/C小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，二周之后加强免疫一次。一周后小鼠尾部静脉取血，ELISA鉴定具有高滴度保护性抗体，选择效价最高的小鼠，将其处死后取出脾脏加入液氮研磨，按50-100mg脾脏加入ImLTrizol试剂，室温静置5min，按每ImLTrizol加入 0. 2mL氯仿加入氯仿，反复剧烈振荡15s，室温静置2-3分钟。4°C，12000g/min离心15min， 吸取水相部分于另一干净1. 5mL的离心管中，按每ImlTrizol加入0. 5mL异丙醇加入异丙醇，颠倒混勻，于_20°C沉淀30-60min，12000g/min离心lOmin。保留沉淀，70%的乙醇洗涤一遍，空气中晾干，DEPC水溶解沉淀RNA。
1. 2逆转录合成cDNA
逆转录是以RNA为模板，在RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)作用下，利用4种 dNTP为原料，在引物的3’端以5’-3’方向合成与RNA互补的DNA链的过程。以提取的免疫脾细胞的总RNA为模板合成cDNA的步骤具体为取oligo (dt) 18 primer (0. 5 μ g/ μ L) 1 μ L， 计算出的RNA体积；DEPC水补足为12 μ L，混合后置65°C，5min,迅速置于冰上，根据反转录试剂盒((Promega公司)的说明书依次加入各试剂，轻微离心后于42°C，60min, 70V，5min 灭活反转录酶，将反转录产物cDNA于-70°C保存。
实施例2重叠延伸法合成单链抗体基因片段
2. 1全套抗体可变区基因的扩增
以cDNA为模板进行PCR反应分别扩增抗体基因重链和轻链可变区。具体步骤为， 在一只0. aiilPCR管内加入下列试剂进行重链可变区扩增免疫脾细胞cDNA 4μ L ;10XPCR buffer 5 μ L ；dNTP (IOmM) 5 μ L ；上下游引物 1 μ L ;Taq (5U/ μ L) 0. 5 μ L，加灭菌超纯水置 50 μ L0另一只PCR反应管内加入以下试剂进行轻链可变区扩增免疫脾细胞cDNA4yL; IOXPCR buffer 5μ L ； dNTP (IOmM) 5 μ L ；上下游引物各 1 μ L ；Taq (5 μ / μ L) 0. 5 μ L，加灭菌超纯水置50 μ L。缓慢用微枪头混合上述液体并短暂地离心。扩增条件94°C预变性4分钟，然后94°C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟，共30个循环。
其中扩增VH的引物为
VHa 5-GTCCTCGCAACTGC jGGCCCAGCCGGC^ ATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3
VHb 5- GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC TGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。
扩增VL的引物为
VLc 5- TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGkCkVlGkGCTCkOlCkGTCTCCS
VLd 5-GAGTCATTCT |GCGGCCGC| CCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。
注B= T，C，G ;K = T，G ;M = A, C ;R = A, G ;S = G，C = A, T ;Y = C, Τ。
方框分别为内切酶SfiI和NotI。斜体部分为扩增Linker序列的部分，黑体加斜体部分为Linker的互补部分。PCR结果分别在约360bp和320bp间出现条带，与预期的大小相符，见图4。
2. 2单链抗体(SCFv)片断的随机拼接及纯化
scFv中的VH和VL是由Linker (接头)连在一起的，Linker的设计对保持亲本抗体的亲和力有重要影响，它应该不干扰VH和VL的立体折叠，不防碍抗原结合部位，不引起分子动力学改变，尽可能减少蛋白酶攻击及防止^Fv聚集。现在最常用的Linker序列是由3个编码亲水性五氨基酸单位(GlyJer)构成。其中甘氨酸是分子质量最小，侧链最短的氨基酸，可增加侧链的柔韧性，丝氨酸是亲水性最强的氨基酸。其取向有两种方式 VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。两种构建方式对kFv的特异性和亲和力无明显影响。但可致大肠杆菌分泌表达的不同。本发明单链抗的组装，采用重叠延伸法(SOE)用接头(G4S)3WDNA片段将克隆的抗体轻、重链可变区基因连接，构成5’ VH-Linker-VL 3’形式。具体步骤为将上述扩增到的VH和VL基因片断分别用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离、回收，然后将VH和VL等量混合作为模板进行重叠延伸PCR以装配kFv片断，条件为 940C Imin变性，55 °C Imin退火，72 °C Imin延伸，共30个循环。PCR产物即为单链抗体基因片断，VH 和 VL 基因之间是 45bp 的 linker 序列GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT GGCGGATCG，共编码15个氨基酸，即为(GGGGS)3，用1. 5%的琼脂糖凝胶回收，结果见图5。
实施例3单链抗体与噬粒载体的连接、初级抗体库的构建及抗体多样性的分析
3. 1单链抗体基因与噬粒载体的连接、单链抗体库的构建
使用T4DNA连接酶(!Iomega)，将经sfil和NotI酶切处理的scFv片段与 PCANTAB5E载体(购自Wiarmacia公司)连接。将连接产物转化到100 μ L TGl感受态细胞，然后加入900yL 37°C预热的2XYT培养基，37°C振荡培养lh，取上步转化后培养的菌液100 μ L，用2XYT培养液做梯度倍比稀释，涂布SOB-AG平板，30°C培养过夜。计数平板上的单菌落数，推算抗体库库容量为3xl06。剩余的转化后培养的菌液，加入IOmL 2XYTGA(Glucose :2%,Amp :100 μ g/mL)，37°C培养至 A600 = 0. 5，使细菌达到对数生长期。 加入 2X101。噬菌体 M13K07(购自 Pharmacia 公司)，37°C培养 lh，4000r/min 离心 IOmin, 重悬沉淀于200mL 2XYT2A K (Amp 100 μ g/mL，卡那霉素:50 μ g/mL)，37°C振荡培养过夜。 4000r/min 离心 IOmin 后，加入 1/5 体积量的 PEG/NaCl (20 % PEG8000，2. 5mol/LNaCl)于 4°C沉淀噬菌体30min，9000r/min离心20min，将沉淀噬菌体重悬于2mL含10g/L BSA的PBS中，12000r/min离心5min，上清经0. 45 μ m滤膜过滤，即获得噬菌体单链抗体库。
3. 2单链抗体多样性的分析
随机挑取10个克隆，用sfil和NotI双酶切，初步鉴定阳性克隆。质粒提取及酶切反应操作和以上步骤相同。pCANTAB5E-scFV示意图见图6。
以 S1，S6 (S 1 5-CAACGTGAAAAAATTATTATT-3 ； S6 5-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3) 为引物进行测序，除2个克隆测序无结果，其他8个克隆(PHL1-PHL8)的测序结果表明序列排列方式为VH-Linker-VL，与小鼠免疫球蛋白可变区序列数据库Kabat比对后发现所有序列均符合小鼠轻重链可变区基因结构。VH部分为357-367bp左右，VL为320_330bp左右， 重链和轻链之间的linker碱基序列全部正确。利用软件DNAstar进行序列比对，同源性达 82%以上，其它有较为明显差异，同源性低于76%。结果见图7。
实施例4抗流感病毒的单链抗体库的富集和特异性抗体的筛选
将免疫管用碳酸盐包被缓冲液将A/PR/8/Hmi流感病毒细胞培养液上清(滴度为1X 105PFU/mL)按1 5 (体积比)稀释(包被量2mL/管)，4°C过夜。包被完毕，用PBS洗管3次，拍干；用封闭液脱脂乳PBS，MPBS)封闭免疫管，37°C封闭2小时；倾去封闭液， 用PBS洗管3次，拍干；在洗涤过程中，将上述已获得的初级噬菌体单链抗体库上清，按照 MPBS 上清=2 3的体积比将MPBS和噬菌体上清进行混勻，加入封闭好的免疫管，2mL/ 管，轻摇温育30min后，再静置温育1. 5小时；弃免疫管内噬菌体上清，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干；加入甘氨酸-盐酸(pH2. 2)洗脱液，2mL/管，37°C作用6min后，迅速加入Tris Qmol/L pH 7. 4)，200 μ L/管中和洗脱下来的噬菌体溶液，再加入2mL新鲜的 TGl菌液(购自Wmrmacia公司)(0D值约为0. 5)，37°C作用Ih后，此时，完成了第一轮淘筛，获得了一级抗体库。取部分菌液做10倍梯度稀释后，涂布SOBAG板计算输出的噬菌体淘筛量，剩余菌液加入终浓度为lOOyg/mLamp和2%葡萄糖，同时加入约4X101(IM13 K07噬菌体，静置温育30min后，再250rpm振荡培养30min ； 1000 Xg离心lOmin，去上清，用IOOmL2X YT-AK轻悬细胞，37°C，250转，培养过夜，开始下一轮淘筛，最终经过3轮淘筛，取获得的菌液，用2XYT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液IOOyL涂布SOBAG平板，30°C培养过夜； 选出有约100-200个左右菌落的平板，计算菌落数目，乘以稀释倍数，即得相应库容。经过 3轮特异性富集淘筛，获得了滴度约为5. OX IO4CfuAiL的噬菌体重组抗体库。剩余菌液按照800 μ L以上洗脱菌液+200 μ L(含80%灭菌甘油的2XYT)，混勻后，-70°c冻存，标记为三级抗体库。
实施例5重组噬菌体ELISA初步检测抗原阳性重组抗体
取72个1. 5mL的离心管置培养架上作为培养板，每孔加入2XYT-AG培养基 400 μ L ；挑取上述中的SOBAG平板上长出的单个菌落，接种至上面各孔中，此板标记为 Master Plate ；将Master Plate置于摇床，30°C，250rpm，振荡培养过夜；次日，另取72孔培养板，取40(^1^含有2.5\101(^伪/11^ M13K07的2XYT-AG至每孔，此板标为Pl Plate ； 从过夜培养的Master Plate上每孔取40 μ L培养液至Pl Plate^fPl Plate置于摇床， 37°C,150rpm/min,振荡培养2小时，1500Xg离心20min,小心去上清；向Pl Plate每孔加入400 μ L 2 X YT-AK培养液，37"C，250rpm,振荡培养过夜；1500 X g离心20min,小心取上清待用。取实施例1所制的A/PR/8/Hmi流感病毒细胞培养液上清4°C包被酶标板过夜，2%M PBS(含2%脱脂乳的PBQ封闭，洗涤后，以上面获得噬菌体液为一抗，37°C孵育2h，HRP标记的抗M13单抗为二抗，37°C反应lh，洗涤后加入TMB显色液，37°C反应30min， 加入2M硫酸终止显色，酶标仪450nm波长下测OD值，设Mi;3K07包被对照孔(阳性对照)和空白包被对照孔，找出阳性克隆(0D值彡0. 3且OD值/OD空白孔彡3可以确定为阳性克隆)。ELISA测定各孔上清与A/PR/8/Hmi流感病毒的结合情况，结果发现4株克隆与抗原有阳性反应，初步确定这4株重组克隆为阳性。其中一株噬菌体抗体为强阳性， 命名为 WJY001，提取此克隆的重组质粒，以 Si，S6(S1 5-CAACGTGAAAAAATTATTATT-3 ；S6 5-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3)为引物做PCR鉴定，结果见图5，将目的片段用胶回收试剂盒回收后送上海英骏公司测序，测序结果表明目的^Fv序列共74!3bp，序列排列方式为 VH-Linker-VL,与小鼠免疫球蛋白可变区序列数据库Kabat比对发现序列符合小鼠轻重链可变区基因结构。命名为SIVHL1，测序结果见图1。
实施例6抗流感病毒的噬菌体单链抗体活性的鉴定
6. 1阻断ELISA鉴定阳性克隆噬菌体重组抗体WJY001
按照最佳包被条件，将抗原实施例1所制的流感病毒细胞培养上清包被96孔板， 4°C包被过夜。2% MPBS (含2%脱脂乳的PBQ封闭，将A/PR/8/Hmi流感病毒液浓缩后置于DMEM培养基透析平衡，最终浓缩成4倍，然后用DMEM培养基倍比稀释2个梯度(分别相当于4倍、2倍、1倍的A/PR/8/Hmi流感病毒的细胞培养上清液)，每一梯度，设立阻断孔和非阻断孔，各为三重复，病毒液与阳性克隆噬菌体液各50 μ L在孔外室温反应30min，移置阻断孔，DMEM细胞培养液与阳性克隆噬菌体液同样反应后移置非阻断孔，37°C反应lh， 洗涤后加入HRP标记的抗M13单抗100yL，37°C反应lh，洗涤；显色加入200 μ L/孔TMB 显色液，370C孵育显色15min左右；终止用200 μ L/孔终止液，终止显色。结果显示用来阻断的病毒浓度越高，剩下能够与已包被在ELISA板上得病毒反应的噬菌体单链抗体量越少，ELISA的0D450值越小，结果见表1，说明WJY001噬菌体单链抗体与A/PR/8/Hmi流感病毒的结合反应的特异性较好。
表1.不同浓缩浓度的Hmi流感病毒液与WJY001噬菌体单链抗体结合的阻断 ELISA结果
权利要求
1.一种抗流感病毒的单链抗体，其是下列蛋白质之一1)由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头肽连接而成的单链抗体，其中轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示；2)如1)所述的单链抗体经过改造得到的衍生抗体，所述的改造包括氨基酸的缺失、取代或插入，并且该衍生抗体具有抗流感病毒的抗体活性。
2.如权利要求1所述的单链抗体，所述的接头肽是15-20个氨基酸缩合而成的短肽。
3.编码如权利要求1或2所述的抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，是下述基因之一1)该基因编码抗体轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如序列表中SEQID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示；2)在严谨条件下该基因编码抗体轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别可与SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4限定的DNA序列杂交，且该基因编码的蛋白质具有抗Hmi流感病毒的抗体活性。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的载体是质粒pET28a。
7.含有权利要求5所述表达载体的宿主。
8.如权利要求7所述的宿主，其特征在于，所述的宿主是大肠杆菌。
9.一种制备权利要求1所述的抗Hmi流感病毒的单链抗体的方法，其特征在于，包括将权利要求5所述的表达载体转化、转导或转染宿主细胞，培养宿主细胞，从培养物中分离蛋白，得到抗Hmi流感病毒单链抗体。
10.权利要求1或2所述的抗体在制备抗流感药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗流感病毒的单链抗体ScFv及其制备方法和应用，以及编码该单链抗体的基因，含有该基因的载体和宿主细胞等。该抗流感病毒的单链抗体，其是下列蛋白质之一1)由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头肽连接而成的单链抗体，其中轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；2)如1)所述的单链抗体经过改造得到的衍生抗体，所述的改造包括氨基酸的缺失、取代或插入，并且该衍生抗体具有抗H1N1流感病毒的抗体活性。本发明的单链抗体分子量约为27kD，能够特异识别H1N1流感病毒，阻断病毒与天然血清的结合。能用来诊断、预防、控制和治疗H1N1流感病毒的感染，或者用于抗病毒的转基因动物育种。
文档编号A61P31/16GK102558348SQ201210063870
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者刘迎春, 史子学, 宋宁宁, 李欣彤, 杨康, 王权, 石金磊, 蒋蔚, 陈永军, 顾惠明, 马志永 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所