专利名称：一种h5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于禽类疫病检测技术领域，具体涉及一种能同时对H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体进行批量检测的ELISA检测试剂盒，适用于动物疫病流行病的调查与检测。
背景技术：
禽流感和新城疫都是流行于禽类中的烈性传染病，严重威胁畜禽业的正常发展，养鸡场的禽类一旦感染这些疫病，将造成严重的经济损失。禽流感(avian influenza, Al)是由禽流感病毒引起的一种主要流行于鸡群中的烈性传染病。其病毒分为不同的亚型，迄今已经发现16个HA亚型(Hl — H16)的禽流感病毒，鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟均可感染，发病情况轻重不一，有的急性死亡，有的无症状带毒，其中H5亚型的禽流感病毒能引发高致病性禽流感，其发病率和死亡率极高，是危害禽类的主要烈性传染病之一，OIE将其列为A类疫病。新城疫(newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血和高度接触性传染病，其以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的主要传染病之一，OIE将其列为A类疫病。由此可见，养 殖场的禽类一旦感染到禽流感和新城疫的病毒，将会导致禽肉类市场供求关系混乱、禽产品出口受阻、政府财政负担加重和公众恐慌。因此，使用禽流感和新城疫的疫苗进行免疫注射，并对免疫效果进行检测以确定其是否产生相应的抗体保护具有非常重大的意义。
实用新型内容本实用新型目的在于提供一种能同时、批量、有效检测H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒。为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案:一种H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体，其中，所述盒体内设有抗原包被反应板、H5亚型禽流感抗体阳性对照血清、新城疫抗体阳性对照血清、H5亚型禽流感抗体阴性对照血清、新城疫抗体阴性对照血清、20 X浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。具体的，所述抗原包被反应板的规格为96孔(96T)，从左至右被均分为检测区I和检测区II两个区域，每个区域有48T，所述检测区I包被H5亚型禽流感病毒蛋白抗原，检测区II包被新城疫病毒蛋白抗原。所述的酶标结合物为酶标记的抗鸡IgG。上述的H5亚型禽流感病毒蛋白抗原和新城疫病毒蛋白抗原均为高纯度的原核表达蛋白，可按照本领域常规技术制备或购买市售产品均可。盒体内可分为抗原包被反应板和试剂反应体系两部分；抗原包被反应板可以用PS材质的酶标板制成，试剂反应体系的包装瓶可以是聚丙烯瓶。本实用新型采用酶联免疫间接法，将H5亚型禽流感病毒蛋白抗原和新城疫病毒蛋白抗原分别包被到包被反应板对应的两个检测区域内，所包抗原可分别与待检测样品中的特异性抗体反应，形成抗原-抗体复合物被吸附到固相包被反应板上，再加入酶标结合物(酶标记的抗鸡IgG)，形成固相病毒抗原-病毒抗体-抗鸡抗体-HRP免疫复合物。如果待检样品中含有相应的抗体，加入显色剂后即为酶催化显色，为阳性；反之为阴性。 本实用新型所述试剂盒通过对包被反应板的抗原包被浓度和酶标记结合物浓度的调整，使其能够产生特异性显色，从而进行H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的检测。该试剂盒能同时对H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体进行批量检测，具有灵敏度高、特异性好、快速检测大批量样品等优点，可用于动物疫病流行病的检测与调查。
图1为本实用新型所述试剂盒的横切面剖视图，即盒体内设置的组成及位置示意图；图中，I为抗原包被反应板；4为ImL H5亚型禽流感抗体阳性对照血清；5为ImL新城疫抗体阳性对照血清；6为ImL H5亚型禽流感抗体阴性对照血清；7为ImL新城疫抗体阴性对照血清；8为50mL 20 X浓缩洗涤液；9为IlmL样品稀释液；10为IlmL酶标结合物；11为6mL显色剂A ;12为6mL显色剂B ;13为6mL终止液；14为盒体；图2为图1中的抗原包被反应板的结构示意图，图中，I为抗原包被反应板；2为检测区I ;3为检测区II。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型做进一步说明，但本实用新型的保护范围不限于此。如图1和2所示，一种H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体14，其中，所述盒体14内设有抗原包被反应板1、H5亚型禽流感抗体阳性对照血清4、新城疫抗体阳性对照血清5、H5亚型禽流感抗体阴性对照血清6、新城疫抗体阴性对照血清7、20X浓缩洗涤液8、样品稀释液9、酶标结合物10、显色剂A 11、显色剂B 12和终止液13。所述抗原包被反应板I的规格为96T，从左至右被均分为检测区I2和检测区II 3两个区域，每个区域有48T，所述检测区I 2包被H5亚型禽流感病毒蛋白抗原，检测区II 3包被新城疫病毒蛋白抗原。抗原包被反应板I为PS材质的酶标板。本实用新型所述试剂盒采用酶联免疫间接法制备，具体制备工艺如下:(I)抗原包被反应板I的制备:将96T酶标板从左至右均分为检测区I 2和检测区II 3共两个检测区(见图2)。其中，用抗原稀释液稀释H5亚型禽流感病毒蛋白抗原使其终浓度为0.2Pg/mL，按IOOPL/孔包被检测区I 2 ;用抗原稀释液稀释新城疫病毒蛋白抗原使其终浓度为0.5Pg/mL，按IOOPL/孔包被检测区II 3 ;然后用封板膜封板2— 8°C过夜。次日，洗板I次，按150μ 7孔加入封闭液，37°C封闭2h ;然后吸出孔内液体，置37°C烘箱中烤干，最后用铝箔袋热封装袋保存。上述抗原稀释液、封闭液的具体组分配比如下:A抗原稀释液:每IOOOmL纯化水中含碳酸钠1.70g和碳酸氢钠2.86g。B封闭液:每IOOOmL纯化水中含牛血清白蛋白6g、蔗糖40g、胰蛋白胨IOg和proclin300 ImL0(2) H5亚型禽流感抗体阳性对照血清4的制备:将H5亚型禽流感抗体阳性血清
0.1mL加入到浓度0.01mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液中，最终定容至100mL，然后按ImL/瓶的规格进行分装。(3)新城疫抗体阳性对照血清5的制备:将新城疫抗体阳性血清0.2mL加入到浓度
0.01mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液中，最终定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的规格进行分装。(4) H5亚型禽流感抗体阴性对照血清6的制备:将H5亚型禽流感抗体阴性血清ImL加入到浓度0.01mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液中，最终定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的规格进行分装。(5)新城疫抗体阴性对照血清7的制备:将新城疫抗体阴性血清ImL加入到浓度
0.01mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液中，最终定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的规格进行分装。(6)20 X浓缩洗涤液8的制备:将4g磷酸二氢钾、58g十二水磷酸氢二钠、160g氯化钠、IOmL吐温-20和ImL Proclin 300加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按50mL/瓶的规格进行分装。(7)样品稀释液9的制备:将1.28g磷酸二氢钠、0.41g磷酸氢二钠、20.09g氯化钠、ImL吐温_20、50mL新生牛血清、0.2g指示剂、ImL曲拉通X-100和ImL Proclin 300加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按IlmL/瓶的规格进行分装。(8)酶标结合物10的制备:将2.42g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、酶稳定剂0.Sg、IOOmL新生牛血清、1.5mL曲拉通X_100、8.5g氯化钠、ImL Proclin 300、lg红色染料、
·1.65mL浓盐酸和0.5mL HRP-抗鸡IgG抗体加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按IlmL/瓶的规格进行分装。(9)显色剂A 11的制备:将柠檬酸2.10g、结晶乙酸钠12.25g和过氧化脲0.6g加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按6mL/瓶的规格进行分装。(10)显色剂B 12的制备:将柠檬酸2.10g、EDTA 0.3g、TMB_HCl 0.6g加入到纯化水中，最终定容至1L,然后按6mL/瓶的规格进行分装。(11)终止液13的制备:将浓硫酸108.5mL缓慢溶于纯化水中，定容至1000ml，然后按6mL/瓶的规格进行分装。(12)组盒:每个试剂盒配备I块抗原包被反应板、I瓶H5亚型禽流感抗体阳性对照血清、I瓶H5亚型禽流感抗体阴性对照血清、I瓶新城疫抗体阳性对照血清、I瓶新城疫抗体阴性对照血清、I瓶20 X浓缩洗涤液、I瓶样品稀释液、I瓶酶标结合物、I瓶显色剂A、I瓶显色剂B和I瓶终止液，组成一个试剂盒。本实用新型采用高纯度的H5亚型禽流感病毒蛋白和新城疫病毒蛋白作为包被抗原进行特异性的H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的检测。其原理是:将H5亚型禽流感病毒蛋白抗原、新城疫病毒蛋白抗原分别包被到抗原包被反应板I的检测区I 2和检测区II 3中，所包抗原可分别与待检测样品中的特异性抗体反应，形成抗原-抗体复合物被吸附到固相包被反应板上，再加入酶标记的抗鸡IgG，形成固相病毒抗原-病毒抗体-抗鸡抗体-HRP免疫复合物。如果待检样品中含有相应的抗体，加入显色剂后即为酶催化显色，为阳性；反之为阴性。该试剂盒的使用说明，其具体操作步骤如下:[0035](I)配洗液:将50ml的20X浓缩洗涤液加纯化水稀释至1000ml，充分摇匀后备用。(2)编号:每次试验应在抗原包被反应板的检测区I和检测区II上分别设空白对照孔I L，阴性对照孔2孔，阳性对照孔2孔，其余为待检样品孔。(3)加样品稀释液:用加样器在抗原包被反应板的待检样品孔中加入样品稀释液，每孔100μ I ;空白对照孔、阴性对照孔及阳性对照孔不加样品稀释液。(4)加样:分别于各待检样品孔加入待检样品10μ 1，检测区I上的阴性对照孔加入Η5亚型禽流感抗体阴性对照血清100 μ 1，阳性对照孔加入Η5亚型禽流感抗体阳性对照血清100 μ I。检测区II上的阴性对照孔加入新城疫抗体阴性对照血清100 μ 1，阳性对照孔加入新城疫抗体阳性对照血清100 μ I ;空白对照孔不加样。(5)温育(一):充分混匀，贴上封板膜，37±2°C温育30分钟。(6)洗板(一):洗板机洗或手洗5次。(7)加酶标结合物:除空白对照孔以外，各孔中加入酶标结合物100 μ I。(8)温育(二):贴上封板膜，37±2°C温育30分钟。(9)洗板(二):洗板机洗或手洗5次。(10)加显色剂:每孔加入显色剂A 50 μ 1，全部加完后再在每孔中加入显色剂B50 μ 1，混匀。(11)温育(三):37 ±2 °C 显色 10 分钟。(12)终止:显色完毕后立即于每孔加50 μ I终止液，混匀。(13)测定:终止后应在10分钟内完成判读。对空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长处测定吸光值0D。或使用双波长测定吸光值，测定波长为450nm，参考波长可选630nm或 655nm。(14)结果判定:试剂盒阈值=0.1+阴性对照OD平均值。若阴性对照OD平均值^ 0.05则按实际值计算；若阴性对照OD平均值< 0.05则按0.05计算。若待检样品OD值<试剂盒阈值，结果判为阴性；若待检样品OD值>试剂盒阈值，结果判为阳性。按照各个检测区的阴性对照OD平均值分别计算出相对应的阈值，即可通过各个检测区待检样品孔的OD值与该检测区的阈值进行比较，判定各样品的结果。本实用新型试剂盒能同时对H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体进行批量检测，具有灵敏度高、特异性好、快速检测大 批量样品等优点，可用于动物疫病流行病的检测与调查。
权利要求1.一种H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体，其特征在于，所述盒体内设有抗原包被反应板、H5亚型禽流感抗体阳性对照血清、新城疫抗体阳性对照血清、H5亚型禽流感抗体阴性对照血清、新城疫抗体阴性对照血清、20X浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。
2.如权利要求1所述H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述抗原包被反应板的规格为96孔，从左至右被均分为检测区I和检测区II两个区域，每个区域有48孔，所述检测区I包被H5亚型禽流感病毒蛋白抗原，检测区II包被新城疫病毒蛋白抗原。
3.如权利要求1所述H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的 酶标结合物为酶标记的抗鸡IgG。
专利摘要本实用新型涉及一种H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体，其中，所述盒体内设有抗原包被反应板、H5亚型禽流感抗体阳性对照血清、新城疫抗体阳性对照血清、H5亚型禽流感抗体阴性对照血清、新城疫抗体阴性对照血清、20×浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。该试剂盒能同时批量检测出待检样品中是否含有H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体，具有灵敏度高、特异性好、快速检测大批量样品等优点。
文档编号G01N33/569GK203101396SQ20132008966
公开日2013年7月31日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者赵林萍, 曾小宇, 张如民, 任宝红, 李丹, 孙强, 苗银萍, 王鹏, 李慧英, 王集美, 鲁龙, 孙帅岭, 魏卓, 王思敏, 杨阳, 岳峥 申请人:郑州中道生物技术有限公司