可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及验证方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其设及一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达 的多肤片段及验证方法。
【背景技术】
[0002]AtDPBF4/E化基因编码了一个碱性亮氨酸拉链类化-n巧转录因子，其表达产物 在拟南芥种子胚胎发育晚期基因表达调控，种子萌发W及脱落酸（ABA)信号转导中发挥着 重要的调控作用。与其它典型的转录因子一样，AtDPBF4/E化也含有重要的两个功能域： DNA结合结构域值抓）和转录激活域（TAD)，前者与基因启动子区的上游激活序列0JA巧结 合，后者与一种称为介导因子（Mediator)的蛋白质复合物中的某些区域结合，介导因子还 可同时与RNA聚合酶II转录机器相互作用，运些蛋白质-DNA，蛋白质-蛋白质相互作用就 激活或抑制了祀基因的表达，从而在转录水平调控相关基因表达的开启或关闭。
[0003]W往的研究结果表明，AtDPBF4/E化中负责与DNA结合的区域就是簇基端的位于 碱性亮氨酸拉链区下游的某些氨基酸残基，而负责激活转录的功能域的研究尚处于探索阶 段。有研究报道称，转录因子化f2与GAL4D抓融合表达至酵母菌细胞时，只表现出微弱地 转录激活活性，而将化f2的第113至251位氨基酸残基与GAL4D抓融合表达至酵母菌细 胞时，则表现出很强的转录激活活性；研究人员在对FHL3缺失突变分析时发现，其LIM4结 构域中的第二个锋指结构单独与GAL4D抓融合表达至酵母菌细胞时，可激活报告基因的转 录。到目前为止，国内外尚未见AtDPBF4/E化中能激活基因表达的多肤片段的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肤片段及验 证方法，旨在更加深入地解析特定转录因子激活相关生物性状基因表达、培育具期望生物 性状的植物/作物的分子途径。 阳〇化]本发明是运样实现的，一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肤片段，其特 征在于，包括AD1多肤片段和AD2多肤片段，其中，所述AD1多肤片段如SEQ IDN0:1所示 (GKPLGSMNL呢LLKTVLPPAE巧；所述AD2多肤片段如沈QIDN0:2所示（NIASNGQWVEYH册PQQ QQGFMTYPVCEMQDMVMMGGLSDTPQAP)〇
[0006] 本发明进一步提供了上述可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肤片段的验证 方法，包括W下步骤：
[0007] (1)利用PCR技术体外扩增AtDPBF4/E化基因（Gene10:818706)形成一系列缺失 突变体，扩增的缺失突变体分别连接至酵母菌表达载体PGBKT7,分别将空载的PGBKT7质粒 和上述重组质粒转化酵母菌Y187菌株，对各个突变体进行转录激活活性分析；
[0008] (2)根据在酵母菌系统中的AtDPBF4/E化缺失突变分析的结果，合成3'末端相互 覆盖的DNA片段，通过链延伸合成出完整的AD1的编码区序列，延伸产物连接至拟南芥叶肉 原生质体瞬间表达分析效应载体pH犯ff，将重组质粒命名为抑犯ff-ADl ;通过PCR技术体 外扩增出完整的AD2的编码区序列，将扩增产物连接至拟南芥叶肉原生质体瞬间表达分析 效应载体抑犯ff，将重组质粒命名为抑犯ff-AD2 ;
[0009] (3)WpH犯ff作为阴性对照，P册Rep-6作为报告基因载体，利用上述重组质粒 pH犯ff-ADl、重组质粒抑犯ff-AD2进行拟南芥叶肉原生质体瞬间表达分析，验证AD1多肤 片段和AD2多肤片段在植物细胞中具有激活转录的活性。
[0010] 优选地，在步骤（1)中，所述缺失突变体包括D1至D11缺失突变体；所述重组 质粒分别命名为PGBKT7-D1、PGBKT7-D2、PGBKT7-D3、PGBKT7-D4、PGBKT7-D5、PGBKT7-D6、 PGBKT7-D7、PGBKT7-D8、PGBKT7-D9、PGBKT7-D10、PGBKT7-D11 ;其中，
[0011] 所述PCR技术体外扩增AtDPBFV邸L的缺失突变体基因D1所用引物为： 阳01 引 D1 上游引物：5，-CGGAATTCCACTTAGGAAGTTCTGGAAAACCAC-3，
[0013] D1 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3，
[0014] 所述PCR技术扩增D2所用引物为： 阳〇1引 D2上游引物：
[0016] 5' -CGGAATTCCTTGTTCGTCAGGGAAGCTTGACGTTAC-3，
[0017] D2 下游引物：5, -CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3，
[0018] 所述PCR技术扩增D3所用引物为：
[0019] D3 上游引物：5, -CGGAATTCACTACTACTACTCATAAGCAGCCTAC-3，
[0020] D3 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3 '
[0021] 所述PCR技术扩增D4所用引物为：
[0022] D4 上游引物：5 ' -CGGAATTCTTGTTGAGAGCTGGTGTAGTGACTGAG-3 '
[0023]D4 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3，
[0024] 所述PCR技术扩增D5所用引物为： 阳0巧]D5上游引物：
[0026] 5 ^ -CGGAATTCAACATAGCTTCAAATGGGCAATGGGTTG-3 ^
[0027] D5 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3，
[0028] 所述PCR技术扩增D6所用引物为：
[0029] D6 上游引物：5 ' -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0030]D6 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3 '
[0031] 所述PCR技术扩增D7所用引物为：
[0032]D7 上游引物：5 ' -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0033]D7 下游引物：5 ' -CGGGATCCAACAACATTTTCTTGAGGGACTACTG-3，
[0034] 所述PCR技术扩增D8所用引物为：
[0035]D8 上游引物：5 ' -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0036]D8 下游引物：5 ' -CGGGATCCTCTCCAGACCTCATCAACAGTC-3，
[0037] 所述PCR技术扩增D9所用引物为：
[0038]D9 上游引物：5，-CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0039]D9 下游引物：5 ' -CGGGATCCTCGAGGTAACGTCAAGCTTCCCTGAC-3，
[0040] 所述PCR技术扩增D10所用引物为：
[0041] D10 上游引物：5, -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0042] DIO下游引物：5, -CGGGATCCTTCCTCAGCTGGTGGCAAGACAGTC-3' W43] 所述PCR技术扩增Dll所用引物为：
[0044] D11 上游引物：5 ' -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0045] D11 下游引物：5，-CGGGATCCAGAACTTCCTAAGTGGGATTGAAC-3，。
[0046] 优选地，在步骤（2)中，所述链延伸合成完整的AD1的编码区序列所用DNA序列 为：
[0047] AD1正义链序列：
[0048] 5, -CTGAATTCGGAAAACCACTAGGAAGCATGAACCTTGATGAGCTTC TC-3， W例 AD1反义链序列： 阳0加]5>-CTGGATCCTTATTCCTCAGCTGGTGGCAAGACAGTCTTGAGAAGCTCATC-3'
[0051] 所述PCR技术扩增完整的AD2的编码区序列所用引物为： 阳05引 AD2上游引物：
[0053] 5' -CTGAATTCAACATAGCT TCAAATGGGCAATG-3'
[0054] AD2下游引物： 阳化5] 5' -CTGGATCCTTMGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3'
[0056] 本发明提供了一种基于转录因子AtDPBFV邸L的可激活酵母菌和植物细胞基因 表达的两个多肤片段，在本发明中，通过在酵母菌单杂交系统中对AtDPBF4/E化进行双向 缺失突变分析时发现，AtDPBF4/E化中存在两个能激活基因表达的片段，即位于AtDPBFV E化氨基端保守的第38~59位的肤段（AD1)和位于AtDPBFV邸L中部区域非保守的第 132~176位肤段（AD2);将体外合成出AD1和AD2的编码区序列并分别连接至拟南芥叶肉 原生质体瞬间表达分析效应载体pH犯ff，重组质粒命名为抑犯ff-ADl和抑犯ff-AD2,同时 WpH犯ff作为阴性对照，WP册Rep-6为报告基因载体，进行拟南芥叶肉原生质体瞬间表达 分析，结果表明运两个片段（ADUAD2)在植物细胞中也具有激活报告基因（GU巧转录的活 性，即转录激活活性。
[0057] 本发明发现了AtDPBF4/E化中2个全新的转录激活区，为进一步构建抗干旱、耐盐 碱转基因植物提供了基础，同时有助于更深入地了解抗逆性基因表达调控的分子机理，对 基因工程作物的培育和改良具有重要的指导意义。
【附图说明】
[0058] 图1是在酵母菌单杂交系统中AtDPBF4/E化缺失突变分析结果；其中，control: 空载质粒PGBKT7 ;D1 :AtDPBF4/E化中第33-176位氨基酸残基；D2 :AtDPBF4/邸L中第 61-176位氨基酸残基；D3 :AtDPBF4/E化中第96-176位氨基酸残基；D4 :AtDPBF4/E化中第 114-176位氨基酸残基；D5 :AtDPBF4/E化中第132-176位氨基酸残基；D6 :AtDPBF4/E化中 第1-176位氨基酸残基；D7 :AtDPBF4/E化中第1-131位氨基酸残基；D8 :AtDPBF4/E化中 第1-84位氨基酸残基；D9 :AtDPBF4/邸L中第1-71位氨基酸残基；D10 :AtDPBF4/E化中第 1-59位氨基酸残基；D11 :AtDPBF4/E化中第1-37位氨基酸残基。
[0059] 图2是重组质粒抑犯ff-ADl和抑犯ff-AD2经PCR鉴定后的琼脂糖凝胶电泳结果； 其中，M:DNA分子量标志；1 重组质粒抑犯ff-ADl为模板，用一对通用引物扩增出的PCR 产物；2 重组质粒抑犯ff-AD2为模板，用一对通用引物扩增出的PCR产物；3 空载质 粒抑犯ff为模板，