用于检测PEDV变异株抗体的抗原及方法和试剂盒与流程

本发明涉及动物疫病检测领域，具体涉及用于检测PEDV变异株抗体的抗原及其ELISA试剂盒和检测方法。
背景技术：
：猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，PED)病毒病是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起，主要临床症状是哺乳仔猪非常严重的呕吐和腹泻，最后脱水死亡，发病急，是猪的一种传染极强的肠道疾病。最早发现于1971年的英国，随后迅速扩散到世界各地。1976年开始，我国广东、上海等地报道了该病的发生。所有猪只无论品种和大小均易感，母猪、断奶猪、育肥猪、架子猪均有感染性，1周龄内哺乳仔猪感染死亡率达90％-100％。该病具有严重的危害性，给世界生猪市场造成了不可估量的损失。比利时病毒学家Pensaert于1977年通过试验发现并证实了，虽然该病与TGEV在流行病学、临床症状乃至病理变化上都极其相似，但二者并无血清学交叉反应，而属于新的PEDV成员。接种疫苗是其预防的重要手段，1995年起我国开始采用PEDV和TGEV的二联灭活苗和弱毒苗。在一段时间内有效控制了该病的发生，但从2006年起该病出现在了免疫猪群。2010年以来，该病以空前的态势开始暴发，先后在中国大陆、美国、加拿大、日本、中国台湾地区和墨西哥等地发生，我国2010年-2014年猪场腹泻病的罪魁祸首是PEDV。目前的流行毒株基因序列变异大，导致氨基酸的较大变异，致使疫苗临床效果不明显。PED除了致死率不断升高外，流行季节、持续时间和感染范围也与先前报道有所不同，并且猪群发病更加频繁，给世界养猪业带来严重威胁和巨大挑战。PEDV的核酸长28Kb左右，正链RNA，线性不分段并具有侵染性。主要编码4种结构蛋白：核衣壳N、纤突S、小膜E和膜糖M，3种非结构的蛋白：Pol(1a/1b)和ORF3，5'-3'顺序为：5'-Pol(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3'。专家根据S基因将猪流行性腹泻病毒分为G1和G2两个比较大的基因群，研究发现G1基因群均存在有不同程度的碱基插入或者缺失的现象(主要以基因插入多见)；而G2基因群主要存在有碱基缺失的点突变现象。通过建立S基因进化树，发现G2分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV的早起分离株，G1分支均为新的PEDV流行株，如韩国和美国流行的毒株。PEDVS基因是免疫优势基因，在以S基因为诊断技术研究和候选基因的疫苗中，表现出良好且特异性非常强的免疫原性。有研究表明，抗PEDV的S蛋白的抗体，不与TGEVS蛋白反应，PEDVS蛋白可以很好地作为ELISA检测的靶蛋白。ELISA方法具有灵敏度高、重复性好、特异性强等优点，并且适合大批量样本的检测。该法既可用于测定粪便中的抗原，也可用于测定血清中的抗体，目前被研究者和临床广泛使用，被许多省市级动物疫病预防控制机构实验室所采用，还是国际贸易指定标准诊断方法之一。技术实现要素：本发明的目的是提供用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的抗原、间接ELISA试剂盒以及检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。利用本发明的抗原及方法和试剂盒可以特异性检测北京地区流行的PEDV变异株抗体。本发明的一方面提供用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的抗原，其氨基酸序列如下：PQDVTRCSANTNFRRFFSKFNVQAPAVVVLGGYLPIGENQGVNSTWYCAGQHPTASGVHGIFVSHIRGGHGFEIGISQEPFDPSGYQLYLHKATNGNTNATARLRICQFPSIKTLGPTANNDVTTGRNCLFNKAIPAHMSEHSVVGITWDNDRVTVFSDKIYYFYFKNDWSRVATKCYNSGGCAMQYVYEPTYYMLNVTSAGEDGISYQPCTANCIGYSANVFATEPNGHIPEGFSFNNWFLLSNDSTLVHGKVVSNQ(SEQIDNO:1)。在一些实施方案中，所述抗原是重组的。在进一步的实施方案中，所述抗原是由大肠杆菌表达的重组多肽。本发明的另一方面提供上述抗原的编码核酸序列。优选所述核酸序列如下(774bp)：CCACAAGATGTCACTAGGTGCTCAGCTAACACTAATTTTAGGCGGTTCTTTTCAAAATTTAATGTTCAGGCGCCTGCAGTTGTTGTACTGGGCGGTTATCTACCTATTGGTGAAAACCAGGGTGTCAATTCAACTTGGTACTGTGCTGGCCAACATCCAACTGCTAGTGGCGTTCATGGTATCTTTGTTAGCCATATTAGAGGTGGTCATGGCTTTGAGATTGGCATTTCGCAAGAGCCTTTTGACCCTAGTGGTTACCAGCTTTATTTACATAAGGCTACTAACGGTAACACTAATGCTACTGCGCGACTGCGCATTTGCCAGTTTCCTAGCATTAAAACATTGGGCCCCACTGCTAATAATGATGTTACAACAGGTCGTAATTGCCTATTTAACAAAGCCATCCCAGCTCATATGAGTGAACATAGTGTTGTCGGCATAACATGGGATAATGATCGTGTCACTGTCTTCTCTGACAAGATCTATTATTTTTATTTTAAAAATGATTGGTCCCGTGTTGCGACAAAGTGTTACAACAGTGGAGGTTGTGCTATGCAATATGTTTATGAACCCACCTATTACATGCTTAATGTTACTAGTGCTGGTGAGGATGGTATTTCTTATCAACCCTGTACAGCTAATTGCATTGGTTATTCTGCCAATGTATTTGCTACTGAGCCCAATGGCCACATACCAGAAGGTTTTAGTTTTAATAATTGGTTTCTTTTGTCCAATGATTCCACTTTGGTGCATGGTAAAGTGGTTTCCAACCAA(SEQIDNO:2)。本发明的另一方面提供用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的间接ELISA试剂盒，其包含上述抗原。在进一步的实施方案中，该试剂盒中进一步包含间接ELISA检测方法所需的一种或多种其它试剂。在优选的实施方案中，所述一种或多种其它试剂可以选自：96孔板、包被液、洗液、封闭液、酶标二抗、显色剂、终止液、阳性对照、阴性对照以及其它所需的试剂。其中，包被液可以是pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，其中含有Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)。其中，洗液可以含有NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Na2HPO41.42g/L，KH2PO40.27g/L、0.05％Tween-20，pH7.2。其中，封闭液可以含有NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Na2HPO41.42g/L，KH2PO40.27g/L、10％胎牛血清。其中，显色液可以包含A液和B液，其中A液含有醋酸钠27.2g/L、柠檬酸27.2g/L、30％H2O20.6ml/L，B液含有EDTA-Na0.4g/L、柠檬酸1.9g/L、甘油100ml/L、TMB0.4g/L。其中，终止液可以含有108.5ml浓硫酸/L，将浓硫酸逐滴加入蒸馏水中制备。本发明的另一方面提供非诊断目的检测样品中检测猪流行性腹泻病毒变异株抗体的方法，其特征在于，使用上述抗原通过间接ELISA方法检测样品中检测猪流行性腹泻病毒变异株抗体。本发明的另一方面提供上述抗原、编码上述抗原的核酸序列或上述试剂盒在制备用于通过间接ELISA方法检测样品中猪流行性腹泻病毒变异株抗体的试剂中的应用。在优选的实施方案中，所述“间接ELISA方法”或“间接ELISA检测方法”包括以下步骤：(1)用纯化的抗原包被固相支持物；(2)在适合于形成抗原抗体免疫复合物的条件下，使固定有上述抗原的固相支持物与待测样品温育；(3)清洗除去未结合的抗体；(4)加入经标记的二抗，在适合于形成抗原抗体免疫复合物的条件下温育；(5)清洗除去未结合的二抗；(6)检测温育混合物中的抗原抗体免疫复合物。在特定的实施方案中，上述步骤(6)“检测温育混合物中的抗原抗体免疫复合物”是显色后测定450nm波长的OD值。在优选的实施方案中，通过间接ELISA方法检测样品中检测猪流行性腹泻病毒变异株抗体包括以下步骤：(1)加入抗原包被液和纯化抗原69ng进行包被，37℃1hr，然后洗涤；(2)加入含10％胎牛血清的封闭液进行封闭，37℃2hr，然后洗涤；(3)加入用封闭液稀释40倍的待检样品；(4)37℃温育30min，然后洗涤；(5)加入用封闭液稀释25000倍的酶标二抗；(6)37℃温育30min，然后洗涤；(7)加入显色剂，37℃避光显色20min；(8)加入终止液；(9)检测每孔OD450值。在更优选的实施方案中，通过间接ELISA方法检测样品中检测猪流行性腹泻病毒变异株抗体包括以下步骤：(1)加入抗原包被液100μl和纯化抗原69ng进行包被，37℃1hr，然后洗涤；(2)加入10％胎牛血清200μl进行封闭，37℃2hr，然后洗涤；(3)加入用封闭液稀释40倍的待检样品100μl；(4)37℃温育30min，然后洗涤；(5)加入用封闭液稀释25000倍的酶标二抗100μl；(6)37℃温育30min，然后洗涤；(7)加入显色剂100μl，37℃避光显色20min，其中显色剂为A液和B液等量混匀；(8)加入终止液50μl；(9)15min内，检测每孔OD450值。在特定的实施方案中，如果待检样品孔的OD450平均值大于等于0.1781，则待检样品为阳性。如果待检样品孔的OD450平均值小于等于0.1524，则待检样品为阴性。其中，所述固相支持物可以是有机或无机多聚物。其中，所述二抗可以是抗IgG抗体、抗IgM抗体和/或抗IgA抗体，且用放射性同位素标记，或用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶进行标记。所述样品是指来自受试者的血液、血清、血浆、尿液、唾液、体液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。在优选的实施方案中，所述样品是血清。在优选的实施方案中，所述受试者是猪。本发明以目前北京地区流行的PEDV变异株的S基因为基础，通过筛选，获得了一种包含S1的主要抗原位点的抗原蛋白，利用该抗原蛋白可以特异性检测北京地区流行的PEDV变异株S蛋白抗体。本发明还利用该抗原蛋白建立了一种特异性强、敏感性高、快速简便的PEDV的间接ELISA抗体检测方法。该检测方法可以更为有效的免疫监测猪群抗体水平和监控PEDV疫情，可用于临床推广，比较适用于基层养殖场进行批量样本的检测，且为PED的快速诊断、流行病学调查和防控提供了理论依据和技术支持。本发明的检测PEDV病毒抗体的方法和试剂盒的优点如下：(1)操作简便：应用间接法检测目前流行的猪流行性腹泻病毒的S蛋白抗体，操作步骤少，普通实验人员即可掌握操作方法，易于推广。(2)可用来诊断猪只是否感染PEDV或者检测猪只免疫疫苗后的针对S蛋白抗体水平，特异性高，检测效果准确。附图说明图1是PEDVS1seg的PCR扩增结果。其中Marker是2kdDNA，1、2、3是PEDVS1segPCR产物。图2是表达载体pET-32a和PEDVS1seg的PCR酶切纯化结果。其中Marker是2kdDNA，1是EcoRⅠ、HindⅢ酶切纯化后的pET32a载体，2是EcoRⅠ、HindⅢ酶切纯化后的PEDVS1segPCR产物。图3是含有重组表达质粒pET-32a/PEDVS1seg的菌落PCR结果。其中Marker是2kdDNA，1-10是10个含有pET-32a/PEDVS1seg的BL21菌落的PCR产物。图4是S1seg蛋白的初步表达及可溶性分析。其中Marker是14-100kDaprotein；1是未诱导的空载体PET32a/BL21全菌；2是18℃180rpm18h诱导的空载体全菌；3是未诱导的重组菌全菌；4是18℃180rpm18h诱导的重组菌全菌；5是18℃180rpm18h诱导的重组菌上清；6是18℃180rpm18h诱导的重组菌沉淀(包涵体)。图5是重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。其中Marker是14-100KDaprotein；1、2是纯化后蛋白。图6是His单抗检测重组蛋白的Western-blot。其中1是重组质粒表达蛋白；2是空质粒对照。图7是猪血清鉴定S1seg蛋白的Western-blot。其中1、2是阳性血清检测；3是阴性血清检测。具体实施方式除非另有说明，本文中所使用术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。本发明中使用的术语“S蛋白抗体”是指动物在感染猪流行性腹泻病毒或者接种猪流行性腹泻病毒疫苗之后，体内产生的能识别S蛋白的抗体。本发明中使用的术语“样品”是指来自受试者的血液、血清、血浆、尿液、唾液、体液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。本发明中使用的术语“纯化”是指从天然环境或重组生产来源中分离的多肽。纯化的多肽可以是通过层析技术获得的纯化多肽。本发明中所述的“包含”、“含有”意指包含但不限于，或基本上由……组成，或者由……组成。为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施例并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。实施例1：PEDVS1(19-277aa)(以下称S1seg)基因的扩增取发病猪小肠(发病猪来自于北京地区)，Trizol法提取RNA，反转录成cDNA，-20℃保存备用。以该cDNA为模板，通过PCR方法获得抗原的核酸序列。设计引物序列P1和P2，并在上下游引物上分别引入EcolRⅠ、HindIII酶切位点，预估产物大小为774bp。引物序列如表1所示，由生工生物工程有限公司合成。表1扩增引物引物名称序列酶切位点P1GGAATTCCCACAAGATGTCACCAGGTEcolRIP2CAAGCTTGTTGGTTGGAAACCACCTTHindIIIPCR反应体系为20μl，其中：加完后瞬时离心8s，反应条件为：94℃4min预变性；进入循环：94℃30s，57℃30s，72℃1min，30个循环；最后延伸：72℃10min。在180伏的电压下电泳，在1％琼脂糖凝胶中电泳观察结果，在750-1000bp之间出现特异性条带，如图1所示。实施例2：原核表达质粒pET-32a/PEDVS1seg构建与鉴定使用限制性内切酶EcoRⅠ、HindIII双酶切S1seg基因的PCR产物和pET-32a质粒(5900bp)，并用胶回收试剂盒纯化酶切产物，在1％琼脂糖凝胶中电泳观察结果，如图2所示，在750-1000bp之间和5000bp以上出现特异条带，和预期大小一致。用T4DNA连接酶进行连接，获得重组质粒pET-32a/PEDVS1seg，将重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中增殖，将转化的BL21涂板培养，对疑似菌落，挑取菌落的一半直接做PCR检测，筛选阳性菌落，结果如图3所示。对于鉴定为阳性菌落者，将剩余菌摇菌培养，直接送菌液进行测序。测序结果如下：核酸序列：CCACAAGATGTCACTAGGTGCTCAGCTAACACTAATTTTAGGCGGTTCTTTTCAAAATTTAATGTTCAGGCGCCTGCAGTTGTTGTACTGGGCGGTTATCTACCTATTGGTGAAAACCAGGGTGTCAATTCAACTTGGTACTGTGCTGGCCAACATCCAACTGCTAGTGGCGTTCATGGTATCTTTGTTAGCCATATTAGAGGTGGTCATGGCTTTGAGATTGGCATTTCGCAAGAGCCTTTTGACCCTAGTGGTTACCAGCTTTATTTACATAAGGCTACTAACGGTAACACTAATGCTACTGCGCGACTGCGCATTTGCCAGTTTCCTAGCATTAAAACATTGGGCCCCACTGCTAATAATGATGTTACAACAGGTCGTAATTGCCTATTTAACAAAGCCATCCCAGCTCATATGAGTGAACATAGTGTTGTCGGCATAACATGGGATAATGATCGTGTCACTGTCTTCTCTGACAAGATCTATTATTTTTATTTTAAAAATGATTGGTCCCGTGTTGCGACAAAGTGTTACAACAGTGGAGGTTGTGCTATGCAATATGTTTATGAACCCACCTATTACATGCTTAATGTTACTAGTGCTGGTGAGGATGGTATTTCTTATCAACCCTGTACAGCTAATTGCATTGGTTATTCTGCCAATGTATTTGCTACTGAGCCCAATGGCCACATACCAGAAGGTTTTAGTTTTAATAATTGGTTTCTTTTGTCCAATGATTCCACTTTGGTGCATGGTAAAGTGGTTTCCAACCAA。对应的氨基酸序列：PQDVTRCSANTNFRRFFSKFNVQAPAVVVLGGYLPIGENQGVNSTWYCAGQHPTASGVHGIFVSHIRGGHGFEIGISQEPFDPSGYQLYLHKATNGNTNATARLRICQFPSIKTLGPTANNDVTTGRNCLFNKAIPAHMSEHSVVGITWDNDRVTVFSDKIYYFYFKNDWSRVATKCYNSGGCAMQYVYEPTYYMLNVTSAGEDGISYQPCTANCIGYSANVFATEPNGHIPEGFSFNNWFLLSNDSTLVHGKVVSNQ。实施例3：PEDVS1seg蛋白的表达与鉴定挑比较大的含重组质粒pET-32a/PEDVS1seg的阳性菌落菌接种于200ml加入氨苄的LB培养基中，在摇床37℃200r/min的条件下振摇培养12h，以此作为种子液。按1:50的比例，接种种子液到含有50mLLB(含氨苄)液体培养基的锥形瓶中，37℃摇菌，至OD600达到0.6～0.8之间，加IPTG至终浓度1mmol/L，在18℃，37℃180rpm振摇诱导培养18h，12000r/min离心1min，倒掉上清液。沉淀使用PBS洗涤3次，加入适量的PBS重悬沉淀。经超声裂解，4℃10000g/min离心10min，按1:4的比例，分别将上清和沉淀做SDS-PAGE鉴定。如图4所示，蛋白，SDS-PAGE结果显示初步表达的S1seg重组蛋白以不溶的包涵体形式存在于沉淀中，上清中几乎没有。使用康为世纪公司的包涵体蛋白纯化试剂盒进行纯化，按照说明书操作，步骤如下：取诱导表达的500ml重组菌株培养物，4℃10000r离心5min，每100mg菌体加入1-5ml细菌裂解液，使用超声破碎仪裂解菌体。10000r4℃离心30min后，分离上清和沉淀，收集沉淀。将沉淀重悬于BindingBuffer中，尽量混匀，冰浴1h溶解包涵体。10000g离心20min，0.45μm滤器过滤上清。将蛋白溶液用移液枪加到柱子上，流速不可太快，尽量保持1小时流出液体为10倍柱体积，回收流出液到干净离心管。使用15倍柱体积的BindingBuffer冲洗柱子，下面放垃圾瓶，洗去杂蛋白。使用ElutionBuffer洗脱，收集洗脱峰。洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡，在4℃条件下保存备用。重组蛋白纯化后进行SDS-PAGE，结果如图5所示。利用His单抗、PEDV阳性猪的血清作为一抗，做Westernblot，发现His单抗和PEDV阳性猪的血清多抗均能很好地识别重组表达的蛋白，如图6和图7所示。实施例4：针对猪流行性腹泻病毒S抗体的ELISA检测试剂盒及其使用方法试剂盒组成：包被液：pH9.60.05M碳酸盐缓冲液(Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加dH2O至1000ml)；PBS：称NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.42g，KH2PO40.27g至1L烧杯中，加dH2O至1000ml；洗液：PBST溶液(含0.05％Tween-20，pH7.2的PBS)封闭液：胎牛血清10ml溶于100mlPBS中；显色液：A液(醋酸钠13.6g，柠檬酸13.6g，30％H2O20.3ml，加dH2O至500ml)；B液(EDTA-Na0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，TMB0.2g，加水至500ml)；终止液：21.7ml浓硫酸逐滴加入178.3ml蒸馏水中；96孔板购自Costar公司，酶标二抗是山羊抗猪的IgG标记HRP抗体，购自EARTYOX公司。检测步骤如下：(1)包被：在96孔板的每孔中加入抗原包被液100μl和抗原69ng，37℃1hr。将液体全部倒掉，轻拍去除使剩余液体。用洗液200μl洗涤，3次，每次静置3min。(2)封闭：加入封闭液200μl，37℃2hr，洗液200μl洗涤，3次，每次3min。(3)加样：分别在阴、阳性对照孔加阴、阳性对照各100μl(用封闭液稀释40倍)，待检孔第1孔加待检血清100μl(用封闭液40倍稀释)，后孔对待检血清做倍比稀释，不要触及孔底和孔壁，轻晃混匀。(4)温育：用封板膜封板后置37度，30min，洗液200μl洗涤，3次，每次3min。(5)加酶标二抗：每孔加酶标二抗100μl(用封闭液25000倍稀释)。(6)温育：用封板膜封板后置37度，30min，洗液200μl洗涤，4次，每次3min。(7)显色：显色剂A与显色剂B等量混匀，每孔100μl，37℃避光显色20min。(8)终止：每孔加终止液50μl。(9)测定：15min内，用酶标仪在450nm波长检测每孔OD值。各步骤经条件摸索，最终确定：96孔板中抗原最佳包被量为，每孔69ng经包被缓冲液稀释的S1seg蛋白，最佳包被条件是37℃1小时，最佳封闭条件为10％FBS，37℃2小时，血清最佳稀释度为1:40，一抗孵育时间37℃30min，二抗最佳稀释度及作用时间分别为1:25000和37℃30min，最佳显色时间为37℃避光显色20min。实施例5：试剂盒性能测试1.阴、阳性血清临界值的确定：用实施例4中所建立的ELISA方法检测20份猪阴性血清，每份血清重复两个孔，依照统计学原理，OD450≥X+3SD时，判定为阳性，OD450≤X+2SD，判为阴性，结果在二者中间时判为疑感染。得出20份阴性血清平均OD450值(X)＝0.10075，标准差(SD)＝0.0257。根据公式，阳性血清OD450≥X+3SD＝0.10075+3×0.0257＝0.1781。阴性血清OD450≤X+2SD＝0.10075+2×0.0257＝0.1524，介于二者之间为可疑。2.特异性检测：检测了CSFV、PRV、PRRSV、PCV和TGEV的阳性血清，均为阴性，只有PEDV阳性血清呈现阳性，和其它临床症状相似的病毒并无交叉现象，说明该ELISA方法具有高度特异性，数据如表1所示：表1不同病毒血清交叉实验结果血清PEDV(+)PEDV(-)PRRSVPRVTGEVPCVCSFVOD4500.9020.1420.190.1380.120.1790.170.8220.1050.0860.1050.0850.140.1130.660.090.060.10.160.1090.104平均值0.7950.1120.1120.1140.1210.1430.129结果判定+------3.敏感性检测：对5份阳性血清做了倍比稀释，如表2所示，确定在1:800稀释条件下，血清都呈阳性，说明本试验建立的ELISA方法敏感性较高。表2不同倍数稀释血清反应结果4.重复性试验：批内重复：如表3所示，同一时间纯化的蛋白，包被96板，用10份血清分别做4个重复检测，变异系数都在10％以下，说明使用同一批抗原包被ELISA板检测结果变异度小，重复性良好。表3批内重复实验结果批间重复：如表4所示，使用不同时间纯化的抗原包被ELISA板，10份血清做了4个重复检测，变异系数都小于10％，说明使用不同时间制备纯化的抗原，检测结果波动不大，变异系数小，重复性很好。表4批间重复实验结果临床样本检测与市售相关试剂盒比较：用上述试剂盒检测了本实验室保存的来自于北京不同猪场的100份猪血清，阳性率为87％。本发明所建立的ELISA方法和市售PEDV抗体检测试剂盒(检测针对M蛋白抗体)进行比较(表5)可知，本发明方法阳性率较高，是因为本方法是针对S蛋白抗体的检测，而S蛋白是PEDV主要的表面免疫原，产生的抗体对宿主有保护作用，而市售试剂盒多针对M蛋白或N蛋白的抗体，M蛋白与N蛋白为病毒内部抗原，激活产生的抗体与S蛋白抗体有差异，且对机体无保护作用。因此，本试验建立的检测方法优于市售试剂盒的方法。表5临床样本检测及与试剂盒的比较阳性血清阴性血清可疑间接ELISA方法87310ELISA试剂盒64360结论:利用上述实验步骤得到的试剂盒，可用于诊断猪只是否感染变异型PEDV或者检测猪只免疫疫苗后的抗体水平。应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。当前第1页1 2 3