一种EB病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测EB病毒抗体的快速检测试剂盒与流程

本发明属于临床医学检测领域，涉及免疫层析检测技术，具体涉及一种用于诊断EB病毒感染的EB病毒抗原，制备该抗原的方法，用该抗原检测EB病毒的快速检测试剂盒。

背景技术：

EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）是人类疱疹病毒4型，由Epstein和Barr在1964年研究非洲儿童恶性淋巴瘤时首次发现的，具有嗜人类B淋巴细胞特性。EBV是一种DNA病毒，呈球形，直径为180～200nm，在B淋巴细胞中复制。人是EBV感染的宿主，病毒主要通过唾液传播。无症状感染多发生在幼儿，90%以上的3～5岁幼儿曾感染EBV。细胞免疫在EBV感染中起着关键性作用，该功能下降将导致EBV的活化。EBV感染的潜伏期为4～7周，前驱症状包括头疼、乏力等，80%的患者可能出现临床三联征：咽炎，发热和淋巴结病。感染可涉及到全身各个器官，一般有发热、食欲减退、恶心、呕吐、腹泻、全身淋巴结肿大、肝脾肿大、皮疹等。有的还可出现神经系统症状，一般需2～4周的恢复期。EB 病毒急性感染可引起传染性单核细胞增多症、噬红细胞综合征、X-连锁淋巴细胞增生综合征等疾病。

上呼吸道感染是一类病原感染的总称，引起上感的病原体80%以上为病毒，EB病毒是引起上感的病原体之一。传染性单核细胞增多症（Infectious Mononucleosis ，IM）是由EB病毒原发感染引起的淋巴细胞增生性传染病，临床表现为发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝脾肿大等，和上感症状相似。主要由飞沫和唾液经呼吸道传播，因而又称为“接吻病”。 IM多数预后良好，少数可引起严重并发症， 造成多系统的病变。所以对于确诊是否是由EB病毒引起的上感症状对于预后和进一步用药有重要的意义。

原发性EB病毒感染过程中首先产生针对衣壳抗原（Capsid Antigen, CA） 的IgM和IgG 抗体，在急性感染的晚期，针对早期抗原（Early Antigen, EA）的IgG抗体出现；在恢复期晚期，针对核抗原抗体产生。抗EBV-CA-IgG抗体和抗EBV-NA-IgG抗体可持续终身。近年来，抗体亲合力检测已用来判断是否急性期感染。由于 EB病毒感染的血清学反应复杂多样，有的病例抗EBV-CA-IgM产生延迟，有的持续缺失或长时间存在，这给EBV-IM的确诊带来一定的难度。

人体感染EB病毒后会产生核抗原、早期抗原、衣壳抗原、膜抗原及淋巴细胞识别抗原等抗原的相应抗体（IgG、IgA、IgM等抗体）。其中，VCA/IgM抗体是出现最早的抗体，90~94%的EB病毒感染者在感染初期能够被检测到，是EB病毒急性感染，也是复发感染的重要标志，是EB病毒感染的早期诊断不可缺少的重要指标。常规的EB病毒实验室诊断方法主要有病毒分离、检测病毒蛋白质及核酸、EBV血清学实验检测抗体等几种方法。病毒分离法一般采用咽漱液直接接种人脐带血淋巴细胞，根据转化淋巴细胞的效率来决定病毒的量。该方法耗时并且需要特殊的组织培养条件，故不适合作为临床检测使用；检测病毒核酸常用的方法有核酸杂交和RT-PCR方法，在病变组织内检测病毒基因核酸和病毒基因组转录产物，在检测条件和技术等方面要求较高，故临床常规检测中不宜采用；血清学诊断主要通过酶联免疫吸附法等方法检测血清中是否存在CA-IgM/IgG抗体、抗核抗原抗体等特异性抗体，由于其具有灵敏度高、特异性好和易于操作等优点，是目前实验室最常用的办法之一，对疾病的诊断有一定的参考价值。EB病毒抗体检测试剂质量取决于抗原的性能，工程表达抗原是制备EB病毒抗原的最佳技术方案。在EB病毒的抗原中，衣壳抗原是一种最佳候选抗原。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供一种工程表达EB病毒自身融合衣壳蛋白特异性抗原，该抗原具有高度的特异性和免疫反应性。抗原具有免疫原性高，无特异反应，抗原表位集中等优点。

本发明的第二目的是提供一种制备工程表达EB病毒自身融合衣壳抗原的方法，该方法利用合成融合基因原核表达，通过包涵体复性制备活性高的特异抗原，该方法制备的EB病毒抗原具有特异性和免疫反应性。

本发明的第三目的是提供一种测定抗EB病毒抗体的试剂盒，该试剂盒为快速“一步检测法”试剂盒，具有灵敏度高、特异性强，检测速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查和场地检疫等多种场合。

本发明的第四目的是提供一种EB病毒抗体全血快速检测装置，它是一种装有滤膜的可以过滤掉红细胞的EB病毒全血检测装置。

本发明的第五目的是提供一种EB病毒IgM抗体直接快速检测装置，它是一种装有风湿因子处理垫的可以去掉样本中风湿因子的EB病毒检测装置。

本发明的主要内容

（1）一种EB病毒抗原，它是一种采用基因工程技术人工合成的抗原。

（2） 一种制备EB病毒抗原的方法，包括人工合成EB病毒融合衣壳抗原基因序列，构建原核表达载体，大肠杆菌表达EB病毒融合衣壳蛋白，采用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组EB病毒融合衣壳蛋白抗原。

（3） 一种EB病毒抗体快速检测方法，包括应用上面（1）中的EB病毒抗原。

（4） 上述（3）中EB病毒抗体快速检测方法，包括（1）中的EB病毒抗原固定到一种硝酸纤维素膜，一种标记抗体（二抗）固定到固相载体上，待测样品与标记抗体（二抗）接触，若待测样品中存在EB病毒抗体，则EB病毒抗体与标记二抗形成抗体-标记二抗复合物，“复合物”在硝酸纤维素膜水平移动，遇到固定到膜上的EB病毒抗原产生反应，带有标记的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固定抗原的位置就会有显色反应；若待测样品不含EB病毒抗体，则“复合物”不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据硝酸纤维素膜固定抗原位置是否有显色反应，来判断检测结果，即待测样品中是否有EB病毒抗体。

（5） 上述（4）EB病毒抗体检测方法，其中待测样品是人的全血，血浆或血清。

（6） 上述（4）或（5）中测定EB病毒抗体的方法，其中的标记抗体（二抗）是标记的抗人IgM或抗人IgG抗体。

（7）上述（4）-（6）中标记抗体是胶体金属颗粒或者彩色胶乳颗粒标记的抗体。

（8） 一种快速检测EB病毒抗体的试剂盒，它所用抗原为上述（1）中的EB病毒抗原。

（9） 上述（8）中用于快速检测EB病毒抗体的试剂盒，其中的标记抗体是胶体金属颗粒标记抗体或者彩色胶乳颗粒标记抗体。

（10） 上述（8）中用于检测的试剂盒，其中的滤血膜是固定有抗红细胞单抗或者多抗的无纺布。

（11） 上述（8）中用于检测的试剂盒，其中的风湿因子处理垫是固定有抗风湿因子单抗或多抗的无纺布。

本发明试剂盒阴阳性符合率、精密性、灵敏度等均符合质量标准要求，有效期内产品质量稳定。类风湿因子、乙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒抗体、巨细胞病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体阳性标本不会对本试剂盒检测结果造成干扰。

下面对本发明进行详细阐述。

本发明的EB病毒抗原，主要通过将EB病毒衣壳蛋白基因构建到原核表达载体pET30a，pET30a-p18-p23表达载体转化大肠杆菌，筛选阳性重组菌，IPTG诱导重组菌表达EB病毒自身融合衣壳抗原蛋白，经细菌裂解、包涵体溶解和重组蛋白结构复性与纯化等步骤获得。

下面将详述本发明制备EB病毒抗原的方法。

从GenBank获取EB病毒衣壳蛋白基因序列，根据呼吸道合胞EB病毒衣壳蛋白基因P18和P23人工合成EB病毒自身融合衣壳蛋白基因序列。目的基因经双酶切后与经同样双酶切过得原核表达载体连接，转化感受态细胞（大肠杆菌）、筛选阳性重组菌。阳性克隆菌提取质粒、双酶切和测序鉴定，证明插入的目的基因正确。重组菌经IPTG诱导表达、离心得重组菌沉淀，菌体重悬于缓冲液后超声裂解，离心获得包涵体形式的的蛋白沉淀，经洗涤后溶于尿素溶液中复性。变性蛋白需要经过结构复性与纯化才能获得天然蛋白的免疫反应原性和达到EB病毒抗体检测的应用标准。

对于EB病毒衣壳抗原重组蛋白包涵体复性方法，可应用透析法、梯度稀释法、凝胶层析法等，优选透析法和梯度稀释法相结合的方法，因为它们易于控制，蛋白复性率高。

对于包涵体复性后EB病毒融合衣壳蛋白的纯化方法，可应用凝胶层析、亲和层析等，优选凝胶层析法，因为它最易于控制，收率高。

通过基因重组获得的EB病毒融合衣壳抗原具有较高的特异性和敏感性。

对于快速测定抗体的方法，这里列举的是优选的方法，如应用各种标记抗体的免疫层析测定，应用各种标记抗体的免疫渗滤法等。

下面详述免疫层析测定方法。

抗EB病毒抗体免疫层析测定方法包括下述步骤：EB病毒自身融合衣壳抗原固定到固相载体1上，标记抗体（二抗）固定到固相载体2上，待测样品与标记抗体（二抗）接触，若待测样品存在EB病毒抗体，则EB病毒抗体与二抗反应形成抗体-标记二抗复合物，该“复合物”在固相1上水平移动，遇到固定到载体1上的EB病毒抗原产生反应，带有标记的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固相载体上固定固定抗原的位置就会有显色反应；若待测样品不含EB病毒抗体，则“复合物”不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据固相载体上固定抗原位置是否有显色反应，来判断检测结果，即待测样品中是否有EB病毒抗体。

对于固相载体1，可应用例如硝酸纤维素膜（NC膜）、PVDF膜等。优选硝酸纤维素膜。

对于固相载体2，可应用例如玻璃纤维素膜，无纺布等任何一种形式。优选无纺布作结合物释放垫，因为它最易于控制。

对于标记的抗体，这里指的是用不同标记物标记的抗体，这里指的是抗人IgM抗体或抗人IgG抗体，可依据被检测抗体的种类适当应用。

本发明的有益效果

（1） 本发明包括EB病毒自身融合衣壳抗原的优化表达，合成了优化的自身融合衣壳蛋白基因序列，这一序列的表达更高，特异性更强。而且本发明还探索出了一套完整的包涵体抗原纯化和复性的方法，制备出的抗原收率高，免疫原性高。

（2） 本发明还制备出了一种一步法检测EB病毒抗体的试剂盒。该试剂盒检测EB病毒的IgG或IgM抗体，利于确证感染的阶段，对于EB病毒的治疗提示作用明显。

（3） 本发明还可以直接检测全血样本，在检测卡上有滤血膜，可以用少量全血样本检测。

（4） 本发明还可以直接检测无需处理风湿因子的样本，在检测卡上有风湿因子处理垫，可以直接检测样品而不受样本中的风湿因子的干扰，

因此，本发明可以通过一次取样一步法全血检测呼吸道EB病毒的感染。适于基层医疗机构和医院门诊。

附图说明

图1 显示了发明试剂—检测板的外观结构示意图

1-检测板 2-加样孔 3-检视窗

图2显示了发明试剂—检测条的外部结构示意图

4-加样端吸水纸层 5-金标抗体层 6-控制线 7-检测线

8-检测层 9-吸水端吸水层 10-衬板

具体实施方式

实施例1 重组EB病毒自身融合衣壳蛋白抗原重组表达、结构复性与纯化

EB病毒衣壳抗原P23-P18融合基因参考GenBank序列 V01555.2，选取P23编码基因BLRF2（氨基酸1~162）和P18编码基因BFRF3的C端基因序列，两段基因之间通过多肽接头(Gly₄Ser)₃ DNA序列连接获得融合基因，进行全基因人工合成，表达载体为pET30a，连接时酶切位点为EcoR I//XhoI，目的基因共750bp（249 aa），转化到BL21（DE3），表达的重组蛋白共297aa，分子量30.8 kDa，等电点11.03。重组蛋白以包涵体形式表达，可用Ni柱纯化。

重组表达载体的构建与鉴定：分别用EcoRI和XhoI对EB病毒融合衣壳蛋白目的基因片段及pET30a质粒进行双酶切，酶切产物纯化回收后，16℃连接过夜，再转入E.coliDH5α感受态细胞，挑取转化菌落提取质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。经PCR及双酶切鉴定，均证实有大小约750bp的基因片段插入载体，与预期的结果一致。测序结果表明插入目的基因片段为750bp，核酸序列与提交合成的EB病毒p18-p23融合基因序列完全相同，构建的表达载体开放阅读框正确，可以表达重组蛋白。

重组蛋白的诱导表达：取50µL pET30a-p18-p23 BL21(DE3)菌液加入到5mL含100 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，37 ℃、200 rpm培养过夜，次日按1:50接种于含卡那霉素的LB培养基中，培养至吸光值OD600为0.6左右时，加入IPTG至浓度为1mmol/L，进行诱导表达4小时，5000rpm离心30分钟，收集菌体，用TE缓冲液悬浮，充分混匀，-80 ℃反复冻融3次，超声破菌，4 ℃、12000 rpm离心15 min，收集上清，沉淀用2 M尿素洗2次，4 ℃、12000 rpm离心15 min，剩余沉淀用8 M尿素溶解，4 ℃保存。沉淀用SDS-PAGE分析蛋白表达量。电泳条件，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。蛋白染色为考马斯亮蓝染色法，考马斯亮蓝R-250染色3h，乙酸-乙醇脱色液脱色至背景无色为止。

重组蛋白的结构复性与纯化：室温条件下用10mmol/L,pH7.2的PBS缓冲液对EB病毒自身融合衣壳蛋白p18-p23重组表达蛋白8M尿素的溶解液进行梯度透析稀释，按溶液中尿素浓度分别为6mol/L、4mol/L、3 mol/L控制稀释梯度，每个梯度稀释的时间分别为3-4h。将完成稀释复性的含3mol/L尿素的溶解液4℃放置24h。稀释复性的溶液10000r/min离心除去沉淀物质，上清液通过以S-300为介质的凝胶层析分离法进行纯化，从而获得重组EB病毒自身融合衣壳抗原。所得重组EB病毒衣壳抗原组分进行SDS-PAGE，以确定蛋白质的分子量及蛋白纯度。电泳条件，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。蛋白染色为考马斯亮蓝染色法，考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，乙酸-乙醇脱色液脱色至背景无色为止。主蛋白条带出现在30.3 kDa处，蛋白纯度达到95%以上。

实施例2 一种EB病毒抗体IgG/IgM金标快速检测试剂盒的制备

上述所得到基因重组EB病毒自身融合衣壳蛋白p18-p23作检测抗原，在硝酸纤维素膜包被检测线；参照图2，制备EB病毒抗体金标快速检测试剂，其组成成分包括：在衬板10上设有加样端吸水层4、检测层8和吸水层9，在检测层和加样端吸水层4之间设有金标抗EB病毒抗体层5，在检测层8上包被有检测线7和质控线6。其中加样端吸水层4和吸水端吸水层9由多层滤纸制成：检测层8为硝酸纤维素膜；金标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体。

检测试剂制备程序包括：制备金标抗体层5和检测层8的质控线6、检测线7的包被，然后再在衬板10上组合金标测试条和检测卡1.在塑料衬板10的两端分别粘贴加样端吸水纸层4与吸水端吸水层9；在其中段粘贴包被检测线和质控线的纤维素层8，在加样端吸水纸层4与纤维素膜层8的交接部位，夹贴含金标抗体层5的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸层4中间，1/5部分在纤维素膜层8上。然后按照4毫米宽、7厘米长规格切条。再参照图2，将检测条组装于塑料盒内形成检测卡1。盒盖上加样孔2正对测试条的加样端吸水纸层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。

上述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤：ⅰ胶体金的制备，取100mg氯金酸溶于1000mL三蒸水中，加入15mL浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，煮沸15分钟，可得到直径为15-50纳米的胶体金颗粒溶液；ⅱ胶体金标记抗人IgG或IgM单克隆抗体，取100ml胶体金溶液，用0.2M碳酸钾溶液调pH为8.4，加入1mg抗人IgG/IgM单克隆抗体，搅拌20分钟，再加入240mg牛血清白蛋白（BSA）,继续搅拌5分钟，4℃静置2-4小时；ⅲ将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，去沉淀，得到上清；ⅳ 将上清液经10000转/分钟离心60分钟得到沉淀；ⅴ将沉淀溶于4mL0.02M pH7.4的Tris-Hcl缓冲液得到胶体金溶液，该溶液中含有0.25%BSA和0.02%叠氮钠；ⅵ将胶体金溶液浸入玻璃纤维或者无纺布至液体开始渗出为止，37℃干燥2小时形成金标抗体层5。

所述的检测层8是在硝酸纤维素膜上设有重组EB病毒融合衣壳抗原构成的检测线7和由羊或兔抗鼠IgM/IgG抗体形成的质控线6。其制备方法是取上述（1）所制备的重组EB病毒衣壳抗原，调浓度为1.5mg/mL，加入2%的甲醇，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7；再取羊或兔抗鼠IgM/IgG抗体调浓度为1.5mg/mL，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5cm处，喷涂质控线6，按2uL/cm设置喷膜量，喷膜后置于37℃干燥2小时，再用0.01mLpH7.0的含10%小牛血清的PBS在37℃下封闭30分钟，0.01mLpH7.0的PBS漂洗，45℃干燥。

实施例3 EB病毒抗体的测定

取血清或者血浆样品10μl滴于检测板1的样品孔2内，再滴加100μl样品稀释液于样品孔2内，在观察窗3观察检测结果，观察结果20分钟内有效。若样品中含有抗EB病毒抗体，则在观察窗内看到检测线和质控线出现两条红色线条，检测结果判为阳性；若血清中不含有抗EB病毒抗体，则在观察窗质控线位置看到一条红色线，检测结果判定为阴性；若观察窗内一条红色都看不到，则检测结果无效。

实施例4 全血样品的检测

本发明实现的EB病毒免疫层析快速检测试剂盒对抗凝全血样本可直接检测，无需血浆或血清分离，其实现的原理在于，在样品垫增加一层滤血膜，滤血膜中固化有抗人血红细胞抗体（单抗或多克隆抗体），检测时，当抗凝血全血进入滤血膜后血液中红细胞被抗体结合到滤血膜上，血浆渗入样品垫，完成检测。

实施例5 分湿因子处理垫的确定

本发明实现的EB病毒免疫层析快速检测试剂盒在检测卡上安装有分湿因子处理垫，可以去除掉样品中的分湿因子，无需提前除去血液样品中的分湿因子。其实现的原理在于，在样品垫增加一层抗分湿因子处理垫，处理垫上固化有抗人分湿因子抗体（单克隆抗体或多克隆抗体），检测时，当血液样品进入样品垫后血液中的分湿因子被抗体结合到处理垫上，其余样品渗入样品垫，完成检测。

实施例6 对临床样品的敏感性和特异性

用本发明的EB病毒抗原及检测方法制备EB病毒抗体（IgM）金标检测试剂，检测58份EB病毒抗体IgM阳性临床血清样品和92份EB病毒抗体IgM阴性临床血清样品来进行特异性和敏感性试验。同时，为了验证本发明的效果，对用本发明的EB病毒抗原进行的金标检测试剂与欧蒙公司产的试剂盒进行符合率分析，结果见表1、表2。

表1：本发明的EB病毒抗原的特异性及敏感性检测结果

表1的结果显示，本发明抗原的敏感性达到93.10%，特异性达到95.65% 。本发明的抗原可以作为进一步研发EB病毒抗体检测试剂盒。

表2： 用本发明抗原进行的检测试剂与欧蒙公司（EUROIMMUN）试剂的符合率分析

表2结果显示，本发明检测试剂盒与欧蒙公司试剂的阳性符合率为94. 83% ，阴性符合率为97.83%，总符合率为96.67%，说明本发明试剂盒的检测结果与欧蒙公司用EB病毒抗体检测试剂盒具有较好的符合率。因此，本发明具有较好的临床应用价值。

需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

<110> 兰州雅华生物技术有限公司

<120> 一种EB病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测EB病毒抗体的快速检测试

剂盒

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 749

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcagctc cacgcaaagt cagattgcct tctgttaagg ctgttgacat gagcatggaa 60

gacatggccg cccgcctggc tcgcctggag tctgagaata aggctctgaa gcaacaggtc 120

ctcagagggg gtgcctgtgc ctcgtctacc tctgttcctt ctgctccagt gcctccgcct 180

gagccgctta cagctcgaca gcgagaggta atgattacgc aggccacggg ccgtttggcg 240

tctcaggcta tgaagaagat tgaagacaag gttcggaaat ctgttgacgg tgtaactacc 300

cgcaatgaaa tggaaaatat attgcaaaat ctgaccctcc gcattcaagt atctatgttg 360

ggtgcaaaag gccaacccag ccctggtgag ggaacacgac cacgagaatc aaacgacccc 420

aacgccaccc gacgtgcccg ctcccgctcc cggggacgtg aagcaaagaa agtgcaaatt 480

tctgatggtg gcggtggaag cggcggtggc ggaagcggcg gtggcggcag cgccgcatcc 540

gctgggaccg gggccttggc atcatcagcg ccgtccacgg ccgtagccca gtccgcgacc 600

ccctctgttt cttcatctat tagcagcctc cgggccgcga cttcgggggc gactgccgcc 660

gcctccgccg ccgcagccgt cgataccggg tcaggtggcg ggggacaacc ccacgacacc 720

gccccacgcg gggcacgtaa gaaacagtag 750