本发明涉及一种环肽化合物，确切的说是该环肽化合物的结构及其合成方法；本发明也涉及该环肽化合物及其药物组合物在预防和治疗结核杆菌方面的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术：
结核病(tuberculosis)是结核分枝杆菌(Mycobacterium)引起的慢性传染性疾病，在人类社会肆虐数千年，是一种世界范围内的流行性疾病。世界卫生组织统计，全球三分之一的人口(约20亿)感染结核杆菌，世界卫生组织2011年公布的第16份全球结核病报告中提到，2010年全球新发结核病患者880万，死亡人数为110万人。虽然结核病新发病率和死亡率呈下降趋势，但因为结核杆菌感染人群总数巨大，所以仍然是当今世界上由单一致病菌引发的死亡人数最高的疾病之一。
结核病的化学药物治疗是人类控制结核病的主要手段。1944年链霉素第一次用于治疗一个垂危结核病病人并取得成功，链霉素的发现标志着现代结核病化疗的开端。随后的20年，是抗结核药物开发的黄金时期，相继成功的研发了一线药物异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(Rifampin)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)和链霉素等。二线药物对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid，PAS)、乙硫异烟胺(ethionamide，ETH)、环丝氨酸等。但由于处方不 当、药品质量低劣或供应不力、患者不坚持服药等原因，结核杆菌产生耐药性的情况越来越严重。
结核病难以根除，主要是其耐药性和持留性。持留性结核杆菌，是指通过缓慢的非增殖代谢、维持在宿主细胞内长期存在的结核杆菌。宿主免疫系统以及抗结核药物能够迅速杀死生长状态的结核杆菌，而对处于非生长状态的持留结核杆菌无能为力。当宿主免疫力下降时或者停止使用抗结核药物后，处于持留状态的结核杆菌就会转化为生长状态，大量繁殖，并获得毒力，重新致病。
现阶段临床上最有效的结核病疗法是DOTS(Directly Observed Treatment,Short Course)疗法，整个疗程至少需要6个月。研究表明，在使用DOTS疗法治疗的前两周，绝大多数的结核杆菌已被杀死，剩余的时间则是用来杀灭持留状态的结核杆菌。由此可以看出，因为结核杆菌的持留性，使得结核病疗程变得如此漫长。冗长的疗程不仅加重了患者的经济负担，也使得患者难于按时按量坚持服药，导致耐药性结核杆菌的不断出现，进一步加大了治愈的难度。随着人们对结核分枝杆菌持留性(persisters)认识的逐渐深入以及分子生物学的快速发展，为研究新靶位的抗持留性结核分枝杆菌药物开辟了一条新途径。异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase，ICL)是乙醛酸循环途径中的关键限速酶之一，对结核杆菌维持其持留状态起决定性作用(McKinney J D等，Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase，Nature,2000, 406:735-738)。因此可选择以异柠檬酸裂解酶作为研究新型抗结核药物的潜在药物靶标。
牛雪等以异柠檬酸裂解酶蛋白为靶蛋白，利用噬菌体7肽库筛选与异柠檬酸裂解酶特异性结合的噬菌体。经过筛选、ELISA检测和DNA序列测定，最终结果表明氨基酸序列为[NPPERSP]的直链肽对异柠檬酸裂解酶有明显抑制作用(YIN Yu-he等，Screening Peptide Inhibitors Using Phage Peptide Library with Isocitrate Lyase in Mycobacterium tuberculosis as Target，CHEM.RES.CHINESE UNIVERSITIES 2011,27(4),635—640)。在实验过程中申请人也发现等十二条直链肽不同程度地对异柠檬酸裂解酶具有抑制作用(Xintao Liu等，Optimization of phage heptapeptide library-screening process for developing inhibitors of the isocitrate lyase homologue from Mycobacterium tuberculosis，Med Chem Res，2014，23:2543–2553)。但由于直链肽药物进入体内后可以被酶迅速代谢降解，半衰期通常很短。化学修饰是延长多肽类药物半衰期的一个有效途径，因此，本发明中，将直链肽合成环肽，并同时对直接链肽和环肽的抑制异柠檬酸裂解酶活性进行检测，结果表明环肽的活性有所提高，表明其具有预防和治疗结核杆菌的用途。
在本发明完成之前，尚无文献报道本发明所述的环肽化合物用于预防和治疗结核杆菌的报道，也未发现该化合物在制备防治结核杆菌的药物中的应用的报道。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种环肽化合物，该化合物是利用固相多肽合成法,按已知异柠檬酸裂解酶抑制剂的直链肽氨基酸序列合成首尾相连的环肽化合物。
本发明的目的这二是将该环肽化合物进行抑制结核杆菌的活性进行检测，结果表明其具有抗结核杆菌的作用。
本发明的特点为：对直链肽进行化学修饰得到的环肽化合物，经活性实验证明，具有防治结核杆菌的作用，该环肽化合物与直链肽相比，稳定性大大增加，半衰期延长，活性和稳定性都得到明显提高，具有很高的药用价值。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现。
一、环肽化合物的合成
一种具有预防和治疗结核杆菌的环肽化合物，其结构式如下：
如上所述的具有预防和治疗结核杆菌的环肽化合物由以下方法得到：
用DMF溶胀Rink Amide-MBHA Resin，在一定的反应体系下将Fmoc-Leu与树脂进行偶联，偶联上后脱除Fmoc保护基；按照“C”—Leu-Thr-Gln-His-Leu-Thr-Val—“N”顺序，从“C”端向“N”端合成，直至最后一个氨基酸；将直连肽首尾Val-Leu相连，将直链肽从树脂上裂 解下来，进行环化，用乙醚沉淀、真空干燥得粗品，粗品经RP-HPLC纯化，得纯品环肽化合物。
其合成路线图如下：
a.脱除Fmoc保护基；b.肽的偶联反应；c.肽与树脂的分离；d.线性肽的环化。
二、环肽化合物的结构确证
将得到的环肽用高效液相色谱法和质谱进行结构确证，具体如下：
1、高效液相色谱法
高效液相色谱分析条件:C18色谱柱(ID4.0mm×250mm，5μm)；流动相A为水：三氟乙酸＝1：0.05,有机相B为乙腈:水：三氟乙酸90：10：0.05；进样量为10μL,流速为1mL/min。检测波长为225nm。
通过高效液相色谱图可知合成的环肽化合物的纯度较高，为单一化合物。
2、质谱法
通过质谱分析，得到谱图如图1所示。
通过质谱分析可知合成得到的环肽化合物的相对分子量为793.4，与目标环肽相对分子量一致。
三、环肽化合物的预防和治疗结核杆菌活性检测
本发明的环肽化合物具有预防和治疗结核杆菌的作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。
1、肽类化合物对结核杆菌H37Ra的MIC测定
取制备好的1mg/mL的结核杆菌H37Ra菌悬液5μL，含菌数量2×103，分别接种于每支含500μL正常状态或限制碳源培养液的24孔板中，然后根据需要在孔中加入1mL用DMSO配制的直链与环肽化合物，肽浓度梯度稀释为：1000、800、500和200μg/mL。以异烟肼(INH)为阳性对照，浓度梯度稀释为1.5、1.0、0.8、0.5和0.2μg/mL。以DMSO和不添加任何化合物的培养菌液作为阴性对照。置37℃恒温孵箱内培养，2-3周观察结果。
实验结果如表1所示。环肽化合物的MIC为200μg/mL而相应的直连肽化合物的MIC为500μg/mL，说明环肽与直链肽相比，抑菌活性大大提高。
表1 各种化合物对H37Ra的最小抑菌浓度
2、肽类化合物对巨噬THP-1细胞毒性测定
MTT法测定环肽对巨噬细胞THP-1的毒性
将稳定感染的巨噬细胞THP-1接种于96孔板，每孔4×104个细胞。向孔内加入RPMI1640培养液(含10％胎牛血清)100μl，其中分别含有环肽化合物浓度为0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0mg/mL，直链肽2.0mg/mL设为实验组，同时用不含药物的RPMI1640培养液为空白对照，含0.4μg/mL的异烟肼(INH)为阳性对照。分别于0d、4d及7d向96孔细胞培养板上每孔加入10μL浓度为5mg/ml的MTT，继续培养4h，培养结束，取出细胞培养板，离心弃上清，每孔加100μL DMSO，混匀后室温放置20min，于570nm检测吸光值。按下述公式计算巨噬细胞存活率。
细胞给予0.5～2.0mg/mL不同剂量多肽，给药后第4d和第7d采用MTT法检测细胞存活率。同时设空白对照组和INH(终浓度为0.4mg/mL)对照组。检测结果如表2所示。
表2 570nm OD值对应细胞存活率
*P<0.05，**P<0.01与直链肽组比较
从表2可以看出，给药后，环肽化合物组随着给药剂量的增加，细胞存活率呈剂量依赖性降低，而且第7d细胞存活率明显低于第4d细胞存活率。同样浓度下，直链肽组细胞存活率明显低于环肽组，INH组细胞存活率低于肽类化合物组。说明环肽对于巨噬细胞THP-1的毒性远远小于直链肽。
3、肽类化合物对巨噬细胞胞内结核杆菌细菌H37Ra抑制作用的测定
结核杆菌与巨噬细胞的比例为10：1(H37Ra浓度1×107/mL，THP-1细胞密度1×106/mL)混合，在终浓度为100mmol/L的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)中诱导细胞分化。96孔板每孔加100μL菌悬液，感染4h后，每孔加含不同浓度目的肽100μL继续培养，环肽化合物给药浓度为0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0mg/mL，直链肽给药浓度为2.0mg/mL。同时用RPMI-1640完全培养液做空白对照，4mg/mL的异烟肼(INH)做阳性对照。以此时作为细菌感染零时，分别于感染后0、4及7d去除板上培养液，每孔加入50μL 1％Triton X-100裂解细胞。待其全部裂解后，每孔加50μL RPMI-1640细胞培养液终止裂解。混匀后每孔分别作1：10和1：100稀释，接种于正常培养基37℃培养18d后计CFU，结果如表3所示。
表3 H37Ra菌落计数(Log10CFU/孔)
*P<0.05，**P<0.01与空白组比较
从表3可以看出，以结核杆菌H37Ra感染THP-1细胞，吞噬对照菌落计数表明细菌已经被细胞有效吞噬。菌落计数表明，H37Ra感染THP-1细胞后细菌可在细胞内繁殖，随着感染时间的延长细菌数量增加。当环肽终浓度为0.5mg/mL时，与空白对照相比，胞内细菌即开始下降，当环肽终浓度为1.0mg/mL时，与空白组相比，出现显著性差异。当环肽终浓度为1.5mg/mL时，与空白组相比，出现极其显著性差异，细菌的生长被明显抑制。这说明细菌感染后，随着给药浓度的增加，细菌菌落数逐渐减少。但在较低浓度(低于1.2mg/mL)时，4d的抑制率明显不如7d的抑制率。说明较高浓度(高于1.5mg/mL)抑菌效果更佳。
在表3中也可以看到随时间增加INH对照组较其他加药组菌落数多，这是因为INH作用期间胞内吞噬细菌处于休眠状态，而多肽是对细胞和细菌同时作用。
4、环肽在血浆中的稳定性实验
将180μL乙腈沉淀后的血浆于37℃孵育5min。分别取20μL浓度为12mg/mL的直链肽和环肽置于正在孵育的血浆中，震荡均匀后 迅速取出20μL混合液置于离心管中，将其记为0min样品，然后分别在5，10，15，20，25，30min各取出20μL样品。
酶解过程的终止：在取出的样品中加入90μL乙腈振荡混匀后，将样品置于冰上5min，再用90μL(体积分数为0.5％)的冰醋酸稀释终止酶解过程。以13000r/min离心15min，取上清液，高效液相色谱仪进行分析，直链肽和环肽的半衰期分别为6min和16.5min，即环肽比直链肽的半衰期延长175％。说明环肽的稳定性较相应的直链肽大大增加。
以上药效学试验表明环肽化合物的最低抑菌浓度远远小于直链肽，其细胞毒性与直链肽相比远远降低，环肽化合物对细胞内H37Ra菌具有明显的抑制作用，在血浆中的稳定性实验结果表明其稳定性大大增加。说明本发明的环肽化合物具有预防和治疗结核杆菌的作用。
综上可知，环肽与直链肽相比毒性更低、抑菌活性更强，稳定性更强，说明本发明的环肽化合物在预防和治疗结核杆菌方面具有实质的突出特点和显著的技术进步。
附图说明
图1为环肽化合物质谱图。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
实施例1直连肽的合成
1、树脂溶胀：取Rink Amide树脂1mmol(s＝0.6mmol NH2/g，100目，交联度为1.0％)，放入多肽合成反应器中，用DMF溶涨30min，排干，加20％哌啶(PIP/DMF)去保护，洗涤。
2、偶联：将Fmoc保护的Leu、HOBT用DMF完全溶解，加入DIC混合均匀，加入到反应器内进行反应。整个反应搅拌充氮，室温下进行0.5-2h取少量树脂，用DMF洗涤后，Kaiser检测偶联反应完全后，排干反应液，树脂用DMF洗涤。
3、Fmoc保护基脱除：加入加20％哌啶(PIP/DMF)去保护，洗涤。
4、重复上述偶联及Fmoc保护基脱除步骤，依次接入Fmoc-Thr、Fmoc-Gln、Fmoc-His、Fmoc-Leu、Fmoc-Thr、Fmoc-Val，其中投料比为：保护氨基酸、HOBT、DIC的投料摩尔比为1:1:1，树脂和保护氨基酸的投料摩尔比为1:3。
5、抽干反应完毕后的肽树脂，称重约得5g。将肽树脂置反应器中，按1g肽树脂∶10ml裂解液的比例加入裂解液(裂解液：TFA∶EDT∶H2O∶TIS＝95∶2∶2∶1)，室温搅拌反应2h，砂芯过滤，收集滤液，将滤液缓慢的加入到冷乙醚中，滤液与冷乙醚的体积比为1：10，静置30min后，过滤，收集沉淀，所得沉淀真空干燥后，利用HPLC纯化得直连肽，并通过质谱确认为：Leu-Thr-Gln-His-Leu-Thr-Val，分子量为811.40。
实施例2肽的环化
1、用水溶解线性肽，使线性肽浓度至0.5mg/ml左右，搅拌下滴加I2液至氧化完全，此即得环化肽粗品溶液。
2、用低压纯化系统对环肽粗品进行初步纯化。根据各批次粗肽的含量和体积，按1g肽/50g树脂比例上样，梯度洗脱，收集目的峰，将收集溶液过0.22μm有机相滤膜、旋蒸浓缩、低温放置备用。
3、用制备液相对低压纯化液进行精制。条件如下：
流动相A：H2O+0.1％TFA；流动相B：ACN+0.1％TFA
流速：50ml/min；检测波长：214nm
梯度：0～8min：5％B～22％B
8～33min：22％B～30％B
33～35min：30％B～50％B
35～43min：50％B
4、分段收集组分，检测合格后，减压浓缩，低温避光放置，备用。精制液脱去TFA或转盐、冻干，得到所需环肽，质谱鉴定产物，分子量为793.4
5、按上述合成方法，得到环肽结构式如下：