杂环构建的三肽环氧酮类化合物及制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物生产领域，具体的，本发明涉及一类新的肽骨架中包含有一个杂 环的三肽环氧酮类化合物、其制备方法和应用，以及所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 随着全球人口的不断增加和人口老龄化趋势的不断加深，同时也因为包括吸烟在 内的各种不健康生活方式的广泛存在及环境的污染，肿瘤已经成为了发达国家威胁人类 健康的头号杀手和发展中国家威胁人类健康的第二号杀手（CA-Cancer. J. Clin. 2011， 61，69-90)。在我国，癌症已成首位死因。2014年2月3日，世界卫生组织（WHO)发表《全 球癌症报告2014》，称中国新增癌症病例和死亡病例高居全球第一位。传统的化学治疗药物 如烷化剂、抗代谢物等普遍存在毒副作用大、易产生耐药性等缺点，而针对信号通路中的关 键蛋白或激酶而设计的抗肿瘤药物正在肿瘤治疗领域中发挥着越来越重要的作用，开发新 型、低毒、高效的抗肿瘤药物关系民生，意义重大。
[0003] 蛋白酶体是一个广泛分布于真核细胞细胞质和细胞核内的多亚基大分子复合物， 具有多种催化功能，控制着细胞内80%-90%蛋白质的代谢，参与细胞周期调控、细胞凋亡、 细胞信号转导、DNA修复及多种生理功能，对细胞生长、发育起到重要的作用。蛋白酶体通 过调控影响细胞信号通路的关键蛋白（如P53，NF-κ B)的水平，进而对各种生命活动发挥 调节作用，而很多这些调节蛋白（如细胞周期蛋白）在肿瘤的发生生长过程中都发挥着重要 作用。蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体活性，影响细胞内多个周期蛋白的降解，促进细胞 凋亡。
[0004] 过去的数十年中，许多结构类型的小分子化合物被发现具有蛋白酶体抑制活性并 且有较强的抗肿瘤作用。目前，已有两个小分子蛋白酶体抑制剂进入临床应用，分别是硼酸 肽类化合物Bortezomib和环氧酮肽类化合物Carfilzomib,这更加验证了蛋白酶体作为肿 瘤治疗靶点的正确性。
[0005] 与Bortezomib相比，环氧酮类化合物Carfilzomib不仅具有良好的肿瘤抑 制作用，还不具有一般蛋白酶体抑制剂的毒副作用：引起神经损害。究其原因，是因 为C ar f i I z 〇 m i b具有更加特异的蛋白酶体抑制活性，对其他蛋白酶的抑制活性明显较 Bortezomib 低（Clin Cancer Res. 2011，17，2734-2743)。Carfilzomib 由美国 ONXY 公 司开发研制，于2012年通过FDA加速审批程序后获批，主要用于已至少接受两种优先级更 高的多发性骨髓瘤患者的治疗(包括第一代蛋白酶体抑制剂Bortezomib和一种免疫调节 剂)。该药和第一代蛋白酶体抑制剂相比有明显的优越性，它能克服传统抗肿瘤药物的耐受 性并有更好的安全性，为多发性骨髓瘤的治疗带来了更多希望。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种杂环构建的三肽环氧酮类化合物，具有下述式I的结构 通式：
R1, R2, R3各自独立选自H、CV6烷基-D、卤代的CV6烷基-DXp 6羟基烷基、Cp6巯基烷基、 CV6烷氧基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基； 其中：D为N(Ra) (Rb)或缺失，Ra，Rb各自独立选自H、OH、CV6烷基、卤代的Cp 6烷基或N 末端保护基； R4, R5各自独立选自H、OH、Cp6烷基、卤代的Cp6烷基或芳烷基； R6选自H，CV6烷基，卤代的Cp6烷基，Cp6羟基烷基，Cp 6烷氧基，卤代的Cp6烷氧基， C (O) O-CV6 烷基，C (O) NH-Cp6 烷基，芳烷基； X为0、S、NH、N-Ch烷基或N-卤代的CV6烷基；
〃或者缺失， 其中R选自H、CV6烷基或卤代的Cp6烷基； 环A选自5~7元的饱和脂肪杂环、不饱和杂环、或者有取代的5~7元的饱和脂肪杂 环、不饱和杂环，所述的杂环包含0~3个选自0、N和S的杂原子并任选地被R8、R9和B 1 基团取代； R8, R9分别独立选自Η、0H，Cp6烷基，Cp6烷氧基，CV6羟基烷基，CV 6巯基烷基，Cp6烷 基-D，芳基，杂环芳基，环烷基和杂环基，这些基团可以被1?素、硝基、氣基、CN、Cp6烷基、齒 代的CV 6烷基，Cp6烷氧基或卤代的Cp6烷氧基取代，每个基团可与一个或多个芳基或杂环 芳基稠合，或与一个或多个饱和或部分不饱和环烷基或杂环稠合； 81和氏相同或不同，分别独立选自0、5』〇〇、(：〇?(1)〇〇或缺失，其中1?。為和&分别 独立选自H、Cp6烷基、卤代的Cp6烷基、Cp6烷氧基、卤代的Cp 6烷氧基，R。、Rd和R6相同或 不同； B选自
'Rf或者是缺失，其中Rf选自HXp 6烷基 或卤代的Cp6烷基； R7选自H、Cp6烷基、Cp6烯基、Cp6炔基、碳环基、杂环基、芳基、C^ 6芳烷基、杂芳基、 C^6杂芳烷基、Rg-ZEZ-C^8烷基、Rg-ZEZ-C^ 8烷基-ZEZ-Cp8烷基、杂环基-MZEZ-Cp8烷基、 (R g)2N-Cp8烷基、杂环基-M或碳环基-M-，这些基团可以被卤素、硝基、氨基、CN、C^ 6烷基、 卤代的Cp6烷基、Cp6烷氧基或卤代的Cp6烷氧基取代，其中，E当旁边出现Z时任选为共价 键，M缺失或为Cp 12烷基，Z当旁边出现E时任选为共价键。
[0007] 优选的，X为0原子； 优选的，L为
、其中R选自H、CV6烷基、卤代的CV 6烷基； B1和B2分别独立优选0、S、N(Rc)或者是缺失，Rc选自H、Cp6烷基、卤代的Cp 6烷基、 (V6烷氧基、卤代的(V6烷氧基；
优选的，环A为六元饱和脂肪杂环、不饱和杂环。
[0008] 优选的，本发明提供了下述化合物，其中，若不作特别说明，所涉及氨基酸均为 L-型氨基酸。
[0009] 4-(批嗪-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Phe-Leu-Leu-环氧酮（5a), 4-(批嗪-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5b)， 4-(批嗪-2-酰基）哌嗪-1-酰基-Phe-Leu-Leu-环氧酮（5c)， 4-(批嗪-2-酰基）哌嗪-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5d)， 4- (4-氟苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5e)， 4- (4-苯甲酰基苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5f), 4-(联苯-4-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5g)， 4- (4-氯苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5h)， 4- (4-甲氧基苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5i)， 4-(异恶唑-3-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5 j)， 4-(噻唑-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5k), 4-(批陡-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（51)， 4-(批陡-3-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5m), 4- (4-氯苯基氨甲酰基）哌嗪-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5n)， 4- (4-甲氧基苯基氨甲酰基）哌嗪-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5〇)， 4- (4-氯苯甲酰氨基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5p)， 4- (4-甲氧基苯甲酰氨基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5q), 4-(吗啉-4-醜基）哌陡-1-醜基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5r)， 3-(批嗪-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5s)， 3- (4-氯苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-环氧酮（5t)。
[0010] 本发明的另一个目的是提供上述目标化合物的制备方法，通过以下步骤实现： (1)化合物6与保护的氨基酸在缩合试剂作用下反应得化合物7,选用的缩合试剂有二 环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三氮唑、N-(3-二甲氨 基丙基）-Ν' -乙基碳二亚胺盐酸盐/1-羟基苯并三氮唑。反应温度0-50°C，反应时间2-8 小时，粗产品可直接用于下步反应。
[0011] (2)化合物7在酸性条件下脱去Boc保护基，选用酸性条件为HCl的乙醚溶液，HCl 的乙酸乙酯溶液，HCl的甲醇溶液，HCl的二氧六环溶液和三氟乙酸。反应温度-10-40°C, 反应时间0. 5-3小时。所得粗产品直接用于下步反应。
[0012] (3)化合物1在酸性条件下脱去Boc保护基得化合物2。选用反应条件同步骤（2)。 所得粗产品直接用于下步反应。
[0013] (4)氨基酸甲酯在碱性条件下与三光气反应得氨基酸甲酯异氰酸酯，选用碱性条 件为碳酸钠，碳酸氢钠，三乙胺或二异丙基乙胺，反应温度-20-0°C，反应时间10分钟-1小 时。异氰酸酯和化合物2在碱性条件下缩合得化合物3,所用碱性条件为三乙胺或二异丙基 乙胺，反应温度0_50°C，反应时间1-6小时，所得粗产品直接用于下步反应。
[0014] (5)化合物3在碱性条件下水解得化合物4。选用碱性条件为氢氧化钠、氢氧化锂、 氢氧化钾，反应温度0_40°C，反应时间0. 5-2小时，所得产品直接用于下步反应。
[0015] (6)化合物4与化合物8在缩合试剂作用下反应得目标产物化合物5。选用缩合 试剂同步骤（1 )，所得粗产品经柱层析分离得纯品。
[0016] 反应式：
其中所用原料6的合成参见文献J JfeiZ泛￡皿2009，公，3028。
[0017] 本发明的再一个目的是提供三肽环氧酮类化合物在制备治疗由蛋白酶体介导的 疾病的药物中的应用。所述蛋白酶体介导的疾病包括恶性肿瘤、神经退行性疾病、免疫性疾 病等。所述肿瘤为骨髓瘤、淋巴瘤等血液肿瘤。
[0018] 本发明的药物剂型为固体制剂或液体制剂，给药途径为口服、注射、吸入或植入。 优选注射给药和口服给药方式，例如注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊和颗粒剂等。
[0019] 本发明的药物由所述的化合物或其多晶型物、立体异构体、前体药物、溶剂合物或 可药用的盐作为活性组分，与可药用的载体或赋形剂制备。
[0020] 实验证明，本发明的由杂环构建的三肽环氧酮类化合物具有很好的蛋白酶体抑制 活性，对RPMI8226、H929等多发性骨髓瘤细胞株有极强的体外增殖抑制作用。
[0021] 本发明以Carfilzomib为先导化合物，设计并合成了一系列全新的小分子短肽类 蛋白酶体抑制剂，以杂环构建的三肽环氧酮类化合物作为其结构特点，并对该类化合物进 行了分子、细胞以及动物水平的蛋白酶体活性抑制评价；同时进行了细胞水平与动物水平 的的抗肿瘤活性研究。结果表明，该类化合物具有极强的蛋白酶体抑制活性及细胞增殖抑 制活性，是有前景的蛋白酶体抑制剂，为癌症治疗药物的研究提供了新的思路。本发明化合 物的合成所需原料易得，路线设计合理，反应条件温和，各步产率高，操作简便，适合工业化 生产。
【附图说明】
[0022] 图1是部分化合物对血细胞中蛋白酶体CT-L的抑制活性。
[0023] 图2 (A-B)是部分化合物对正常小鼠血细胞及心脏组织的蛋白酶体抑制活性。
[0024] 图3 (A-C)是部分化合物对荷瘤小鼠血液及组织的蛋白酶体CT-L抑制活性。
[0025] 图4是化合物对人骨髓瘤RPMI 8226 N0D/SCID小鼠体重的影响。
【具体实施方式】
[0026] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明，以下实施例仅是说明本发明，而不是 以任何方式限制本发明。
[0027] 制备实施例1、4-(吡嗪-2-基氨甲酰基）哌啶-1-甲酸叔丁酯（la，Ib) 将1-(叔丁氧羰基）哌啶-4-甲酸（2. 75g，12mmol)置于50mL三颈瓶中，N2保护下加 入25mL无水CH2Cl2，然后缓缓滴入吡啶（2. 5mL，30mmol)和二氯亚砜（I. lmL，14mmol)，该 反应液置于室温反应半小时。随后，2-氨基吡嗪（0. 95g，IOmmol)和三乙胺（5. 7mL，40mmol) 溶于15mL CH2Cl2后缓缓滴入上述反应液，室温反应6小时。反应液加30mL饱和食盐水稀 释，分出有机层，水层CH 2Cl2提取（15mLX 3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥后减压除去溶 剂，柱层析分离得白色固体 2. 3g，收率 74%。！!!. p. : 134-136°C; 1HNMR (500MHz，CDCl3): δ= 9.55 (s, 1H, pyrazine-H), 8.35 (d, 1H, /=2. OHz, pyrazine-H), 8.23 (s, 1H, pyrazine-H), 7.97 (s, 1H, NH), 4.20 (m, 2H, CH2), 2.81 (m, 2H, CH2), 2.48 (m, 1H, CH), 1.93 (d, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 1.76 (m, 2H, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 307[M+H]+。
[0028] 制备实施例2、4_ (吡嗪-2-酰基）哌嗪-I-甲酸叔丁酯（lc，Id) 吡嗪-2-羧酸（I. 5g，12mmol)置于50ml反应瓶中，加入35mL无水CH2Cl2溶解，随即 加入1-羟基苯并三氮唑（I. 6g，12mmol)和N-(3_二甲氨基丙基）_N' -乙基碳二亚胺盐酸 盐（3. 5g，18mmol)，室温反应半小时。随后，哌嗪-1-甲酸叔丁酯（I. 9g，IOmmol)加入反应 液中，室温反应3小时。反应液加入30mL饱和碳酸氢钠水溶液稀释，分出有机层，饱和食盐 水洗（20mLX 2)，无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂，柱层析分离得白色固体2. 4g，收率83%。 m.p·: 146-148?; 1HNMR (500MHz，CDCl3): 5=8.97 (d，1H，/=1.5Hz，pyrazine-H)， 8.65 (d, 1Η, /=2. 5Hz, pyrazine-H), 8.54 (s, 1Η, pyrazine-H), 3.79 (t, 2H, /=5. 0Hz, CH2), 3. 62 (t, 2H, /=5. 0Hz, CH2), 3. 56 (t, 2H, /=5. 0Hz, CH2), 3. 49 (t, 2H, /=5.0Hz, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 293[M+H] +。
[0029] 制备实施例3、4_ (4-氟苯基氨甲酰基）哌啶-I-甲酸叔丁酯（Ie) 以4-氟苯胺为原料，合成及后处理同制备实施例1。得白色固体2. 4g，收率75%。 m.p·: 147-149°C; 1HNMR (500MHz，CDCl3): 5= 7.47 (m，2H，Ar-H), 7.20 (s，1H， NH), 7.01 (t, 2H, /=8.0Hz, Ar-H), 4.18 (d, 2H, /=12.0Hz, CH2), 2.80 (t, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 2.37 (m, 1H, CH), 1.90 (d, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 1.75 (m, 2H, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 323[M+H] +。
[0030] 制备实施例4、4- (4-苯甲酰基苯基氨甲酰基）哌啶-I-甲酸叔丁酯（If) 以（4-氨基苯基)苯甲酮为原料，合成及后处理同制备实施例1。得白色固体3. Og，收率 73%。m. P. : 162-164? ; 1H NMR (500MHz，CDCl3) : S= 7.82 (d, 2H, /=8. 5Hz, Ar-H), 7. 77 (d, 2H, /=8. 5Hz, Ar-H), 7. 67 (d, 2H, /=9. 5Hz, Ar-H), 7. 58 (t, 1H, /=7. 0Hz, Ar-H), 7.48 (t, 2H, /=8. OHz, Ar-H), 7.41 (s, 1H, NH), 4.18 (d, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 2.78 (t, 2H, /=13.0Hz, CH2), 2.44 (m, 1H, CH), 1.90 (d, 2H, /=11. 5Hz, CH2), 1.77 (m, 2H, CH2), 1.48 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 409[M+H] +。
[0031] 制备实施例5、4_ (联苯-4-基氨甲酰基）哌啶-I-甲酸叔丁酯（Ig) 以4-氨基联苯为原料，合成及后处理同制备实施例1。得白色固体2. 3g，收率60%。 m.p·: 219-221 °C ; 1H NMR (500MHz，CDCl3): 5= 7.57 (m，6H，Ar-H), 7.43 (t， 2H, /=7. 5Hz, Ar-H), 7. 33 (t, 1H, /=7. 5Hz, Ar-H), 7. 22 (s, 1H, NH), 4. 20 (d, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 2.81 (t, 2H, /=12.0Hz, CH2), 2.40 (m, 1H, CH), 1.93 (d, 2H, /=11. 5Hz, CH2), 1.76 (m, 2H, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 381[M+H]+。
[0032] 制备实施例6、4_ (4-氯苯基氨甲酰基）哌啶-I-甲酸叔丁酯（Ih) 以4-氯苯胺为原料，合成及后处理同制备实施例1。得白色固体3. 3g，收率98%。m. p.: 187-189°C; 1HNMR (500MHz，CDCl3): 5= 7.47 (d，2H，/=9.0Hz，Ar-H), 7.42 (s， 1H, NH), 7.27 (d, 2H, /=7. 5Hz, Ar-H), 4.18 (d, 2H, /=13. 5Hz, CH2), 2.77 (t, 2H, /=12.0Hz, CH2), 2.38 (m, 1H, CH), 1.88 (d, 2H, /=ILOHz, CH2), 1.73 (m, 2H, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI