一种治疗金葡菌奶牛乳房炎的多肽及制备工艺的制作方法

本发明提供一种治疗金葡菌奶牛乳房炎的多肽，为一种新的多肽，可用于治疗金葡菌奶牛乳房炎疾病；本发明还公开了该多肽的制备工艺，属于生物制药技术领域。

背景技术：

分选酶（Sortase）是大部分革兰氏阳性病原菌（如链球菌和金黄色葡萄球菌等）表面致病性蛋白锚定的关键蛋白，可识别催化含有“LPXTG”序列的表面蛋白并将之锚定于细胞壁，对病原菌的致病力不可或缺，且其结构在革兰氏阳性病原菌中高度保守。奶牛乳房炎是危害奶牛业生产的重要疾病，造成重大经济损失和严重危害公众健康。目前我国每头病牛的损失约为2000-3600元，每年因为乳房炎造成的经济损失高达300亿元。奶牛乳房炎的致病菌主要为革兰氏阳性致病菌，包括金葡菌和链球菌等，其中金葡菌是奶牛乳房炎的重要致病菌，广泛分布于自然界中，对外界环境的耐受性较强。目前针对奶牛乳房炎的治疗主要以抗生素治疗为主，但是抗生素治疗不仅促进细菌耐药性的发生和发展，抗生素残留也严重威胁公众食品安全。病原菌耐药性日益严重以及国家乳制品安全标准等的出台迫切需要耐药性低和无药物残留或低残留的新型药物。

技术实现要素：

本发明提供一种治疗金葡菌奶牛乳房炎的多肽，为一种新的多肽化合物，可显著抑制金葡菌分选酶催化活性。

本发明进一步提供了一种治疗金葡菌奶牛乳房炎的多肽的制备工艺，适用于工业化生产。

本发明所说的一种治疗金葡菌奶牛乳房炎的多肽，简称：五肽；Leu-Pro-Agr-Asp-Ala；其分子结构如下：

分子式为C₂₄H₄₂N₈O₈；分子量为570.31

本发明所说的一种治疗金葡菌奶牛乳房炎的多肽的制备工艺，包括以下步骤：

1）生成肽键偶联反应

称取2.56g（1mmol）Rink Amide MBHA树脂，装入自动合成仪的反应瓶中，Fmoc保护的氨基酸衍生物（Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Leu-OH为等量）、偶联试剂、DMF分别装入各溶剂瓶中（Fmoc-氨基酸衍生物及偶联试剂相对于树脂4倍(mole)过量）开始合成，具体合成参数如下：反应温度为25℃，偶联反应时间定为50分钟，脱保护时间为10分钟(5min×2次)，偶联反应及脱保护反应溶剂添充量为50ml，树脂洗涤次数为6次，每次1min。最后一个氨基酸偶联结束后，mPEG-SC用甲醇洗树脂5次，通入氮气干燥30分钟。

2）脱保护并切割肽-树脂

脱保护切割试剂为TFA/EDT/苯甲硫醚/茴香醚（92.5∶2.5∶2.5∶2.5）（体积比），脱保护切割试剂添充量为60ml，在N₂保护下、25℃下反应1小时，过滤，收集滤液。树脂再切割30分钟，合并收集液。

3）沉淀

向反应液中加入冷的无水乙醚600ml，-20℃下沉淀20分钟，然后以8000rpm离心10分钟，沉淀再用60ml无水乙醚洗二次，真空干燥，得五肽粗品560mg,粗肽收率为98.2%。

4）粗肽的纯化

HPLC纯化方法：将粗肽配制成100mg/ml的水溶液，进样10ml，流动相 B从5%到15%梯度洗脱30min，收集产物峰。将收集的样品溶液减压蒸馏除去乙腈，冷冻真空干燥。

流动相： A相：水，0.1%TFA，B相：90%乙腈溶液，0.1%TFA

洗脱梯度：B的浓度从5%到15%

洗脱时间：10 min

检测波长：210 nm

流速：10ml/min

纯化方法：五肽粗品配制成浓度为100 mg/ml的水溶液，进样10 ml，流动相 B从5%到15%梯度洗脱30 min，收集产物峰。将收集的样品溶液减压蒸馏除去乙腈，冷冻真空干燥。

5）聚乙二醇修饰五肽

将五肽溶于蒸馏水中配制成1-10 mg/ml的水溶液，用磷酸盐缓冲液（PBS）pH为5.5-8.5稀释至5倍体积，然后加入上述20 mg/ml活性聚乙二醇的乙腈溶液，活性聚乙二醇的与五肽摩尔比为5-20:1。室温反应1-4小时后，用甘氨酸终止反应，用反相高效液相色谱纯化，主峰洗脱液在40℃下旋转减压浓缩，浓缩液冻干，得到聚乙二醇修饰产物。

6）质谱检测确定合成五肽的序列。

本发明所说的一种治疗金葡菌奶牛乳房炎的多肽，通过分选酶活性抑制试验、荧光标记试验、细胞侵袭试验和小鼠金葡菌乳房炎治疗试验证实了多肽对金葡菌分选酶活性的抑制作用及其对金葡菌乳房炎的治疗作用。

本发明的积极效果在于：提供了一种新的多肽物质：五肽，Leu-Pro-Agr-Asp-Ala，可显著抑制金葡菌分选酶催化活性，降低细菌表面蛋白锚定，阻碍细菌粘附定殖，对金葡菌乳房炎具有较好的治疗效果。由于体内多肽降解为氨基酸，后者与乳制品的基本组成单位一致，完全无残留；另外，多肽主要以金葡菌分选酶为靶标，对细菌为选择压力，不易诱导耐药性。

附图说明

图1~图3为实施例1~实施例3多肽对金葡菌分选酶催化活性的抑制作用；

图4~图6为实施例1~实施例3多肽处理后对金葡菌表面蛋白锚定的影响；

图7~图9为实施例1~实施例3多肽对细菌侵袭宿主细胞J774的影响；

图10~图12为实施例1~实施例3多肽抑制金葡菌乳腺组织内定殖；

图13~图15为实施例1~实施例3多肽降低金葡菌乳腺组织内炎症因子。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

多肽合成

称取2.56g（1mmol）Rink Amide MBHA树脂，装入自动合成仪的反应瓶中，Fmoc保护的氨基酸衍生物（Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Leu-OH为等量）、偶联试剂(Py-BOP Reagent和HOBt Hydrate)、DMF分别装入各溶剂瓶中（Fmoc-氨基酸衍生物及偶联试剂相对于树脂4倍(mole)过量）开始合成，具体合成参数如下：反应温度为25℃，偶联反应时间定为50分钟，脱保护时间为10分钟(5min×2次)，偶联反应及脱保护反应溶剂添充量为50ml，树脂洗涤次数为6次，每次1min。最后一个氨基酸偶联结束后，mPEG-SC用甲醇洗树脂5次，通入氮气干燥30 min。脱保护切割试剂为TFA/EDT/苯甲硫醚/茴香醚（92.5∶2.5∶2.5∶2.5）（体积比），脱保护切割试剂添充量为60ml，在N₂保护下，25℃下反应1 h，过滤，收集滤液。树脂再切割30分钟，合并收集液。应用无水乙醚沉淀法和HPLC法获得精制目的多肽；分子式为C₂₄H₄₂N₈O₈；分子量为570.31。

本发明多肽对金葡菌分选酶催化活性的抑制作用见图1；对金葡菌表面蛋白锚定的影响图4；对细菌侵袭宿主细胞J774的影响见图7；抑制金葡菌乳腺组织内定殖见图10；降低金葡菌乳腺组织内炎症因子见图13。

实施例2

多肽合成

称取2.56g（1mmol）Rink Amide MBHA树脂，装入自动合成仪的反应瓶中，Fmoc保护的氨基酸衍生物（Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Leu-OH为等量）、偶联试剂(Py-BOP Reagent和HOBt Hydrate)、DMF分别装入各溶剂瓶中（Fmoc-氨基酸衍生物及偶联试剂相对于树脂4倍(mole)过量）开始合成，具体合成参数如下：反应温度为28℃，偶联反应时间定为40分钟，脱保护时间为15分钟(5min×3次)，偶联反应及脱保护反应溶剂添充量为50ml，树脂洗涤次数为6次，每次1min。最后一个氨基酸偶联结束后，mPEG-SC用甲醇洗树脂5次，通入氮气干燥30 min。脱保护切割试剂为TFA/EDT/苯甲硫醚/茴香醚（92.5∶2.5∶2.5∶2.5）（体积比），脱保护切割试剂添充量为60ml，在N₂保护下，25℃下反应1 h，过滤，收集滤液。树脂再切割30分钟，合并收集液。应用无水乙醚沉淀法和HPLC法获得精制目的多肽。分子式为C₂₄H₄₂N₈O₈；分子量为570.31。

本发明多肽对金葡菌分选酶催化活性的抑制作用见图2；对金葡菌表面蛋白锚定的影响图5；对细菌侵袭宿主细胞J774的影响见图8；抑制金葡菌乳腺组织内定殖见图10；降低金葡菌乳腺组织内炎症因子见图14。

实施例3

多肽合成

称取2.56g（1mmol）Rink Amide MBHA树脂，装入自动合成仪的反应瓶中，Fmoc保护的氨基酸衍生物（Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Leu-OH为等量）、偶联试剂(Py-BOP Reagent和HOBt Hydrate)、DMF分别装入各溶剂瓶中（Fmoc-氨基酸衍生物及偶联试剂相对于树脂4倍(mole)过量）开始合成，具体合成参数如下：反应温度为22℃，偶联反应时间定为80分钟，脱保护时间为10分钟(5min×2次)，偶联反应及脱保护反应溶剂添充量为50ml，树脂洗涤次数为6次，每次1min。最后一个氨基酸偶联结束后，mPEG-SC用甲醇洗树脂5次，通入氮气干燥30 min。脱保护切割试剂为TFA/EDT/苯甲硫醚/茴香醚（92.5∶2.5∶2.5∶2.5）（体积比），脱保护切割试剂添充量为60ml，在N₂保护下，25℃下反应1 h，过滤，收集滤液。树脂再切割30分钟，合并收集液。应用无水乙醚沉淀法和HPLC法获得精制目的多肽。分子式为C₂₄H₄₂N₈O₈；分子量为570.31。

本发明多肽对金葡菌分选酶催化活性的抑制作用见图3；对金葡菌表面蛋白锚定的影响图6；对细菌侵袭宿主细胞J774的影响见图9；抑制金葡菌乳腺组织内定殖见图10；降低金葡菌乳腺组织内炎症因子见图15。

通过以下本发明所述多肽的医疗活性：

1、分选酶活性抑制实验

纯化分选酶（4 mM）与不同浓度三个实施例多肽（3.125 μΜ到25 μΜ不等）共孵育30 min（37℃），加入已修饰的荧光肽底物（Dabcyl-QALPTTGEE-Edans）（10 μM）再次孵育1 h（37℃）。应用酶标仪检测反应体系中荧光强度（激发波长和发射波长分别为350 nm和520 nm）。实验结果表明，经三个实施例多肽处理后，分选酶活性显著下降，且这一作用呈现剂量依赖性，多肽抑制分选酶活性的IC50为10.61 μΜ（图1~图3）。

荧光标记试验

金葡菌USA300及其分选酶敲除子USA300△SrtA与三个实施例多肽共培养2.5 h（37℃），离心（3000 rpm，10 min）收集菌体，应用PBS清洗菌体三次，FITC标记的抗表面蛋白A抗体标记细菌表面蛋白，并应用激光共聚焦显微镜观察三个实施例多肽处理后细菌表面蛋白锚定的影响。实验结果表明分选酶敲除子USA300△SrtA表明无表面蛋白A的锚定，经三个实施例多肽处理后可显著降低表明蛋白A的锚定 (图4~图6)。

细胞侵袭试验

宿主细胞J774与三个实施例多肽处理的金葡菌共培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中（37℃，1 h）。加入300 μg/mL庆大霉素终止侵袭试验，裂解细胞，倍比稀释后涂板菌落计数，分析三个实施例多肽处理下对细菌侵袭宿主细胞的影响。结果表明，三个实施例多肽可显著抑制细菌侵袭宿主细胞J774（图7~图9）。

小鼠金葡菌乳腺炎治疗试验

泌乳母鼠（BALB/c）经乳导管注射金葡菌建立小鼠金葡菌乳腺炎模型，同时经乳管给药（50 mg/kg）（三个实施例多肽）；后续治疗过程中每隔12 h再次给药（三个实施例多肽）。感染后48 h，颈椎脱臼处死感染小鼠并摘取乳腺组织，进行组织菌落定殖数分析及组织炎症因子分析。实验结果表明，经三个实施例多肽治疗后显著抑制金葡菌组织内定殖（图10~12）和降低组织内炎症因子含量（图13~15）。

<110> 吉林大学

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211>

<212> 多肽

<213> 五肽

<400> 1

Leu-Pro-Agr-Asp-Ala