胰岛素样生长因子融合蛋白的制作方法

专利名称：胰岛素样生长因子融合蛋白的制作方法
胰岛素样生长因子融合蛋白本发明涉及胰岛素样生长因子融合多肽和二聚体；编码所述多肽的核酸分子和使 用所述多肽/二聚体的治疗方法。IGF-I是一种70个氨基酸的多肽，分子量为7. 6kD。与其它细胞相比，IGF-I刺激 软骨细胞的增殖，从而导致骨骼生长。IGF-I还牵涉在肌肉的发育中。IGF-I是与受体酪氨 酸激酶(RTK)超家族的成员相互作用的蛋白配体的实例。大约98%的IGF-I结合于六种结 合蛋白(IGF-BP)中的一种。IGF-BP3是最大量的，占IGF-I结合的80%。IGF-I结合两种 受体IGF-1受体(IGFR)和胰岛素受体(IR)；其中前者与IGF-I以较高的亲和力结合。除 了 IGFlR外，RTK超家族的其它成员包括胰岛素受体(IR)、表皮生长因子受体(EGFR，也称 作ErbBl)和相关的ErbB受体、血管内皮生长因子受体(VEGF)和神经生长因子(NGFR)。这 些受体的胞外结构域各含有各种不同结构的多个亚结构域，包括免疫球蛋白样结构域、富 含半胱氨酸的结构域、EGF样结构域。这些细胞因子受体家族的激活认为是由配体介导的 寡聚化引起的，大多数情况下可能是二聚化作用。
其它激素系统可与IGF-I信号转导相互作用。比如，人类生长激素，也称作生长激 素，是一种大约190个氨基酸的蛋白激素/细胞因子，由垂体前叶的细胞合成并分泌。生长 激素具有控制几种复杂的生理过程的功能，这其中包括生长和代谢。生长激素可具有通过 结合响应细胞表达的生长激素受体的直接作用，和主要通过胰岛素样生长因子(IGF-I)介 导的间接作用。因此，生长激素的一种主要作用是刺激肝脏产生IGF-1。缺少IGF-I的产生或者IGF-I不敏感导致的病理学是本领域已知的。严重的原发 性IGF-I缺乏的一个实例是拉伦侏儒症。因为患者不表达生长激素受体，这种疾病对于生 长激素的治疗不响应。严重原发性IGF-I缺乏的其它类型包括带有生长激素受体突变和 IGF-I或者IGFR突变的患者。除此之外，已经评估了重组IGF-I在治疗大量疾患，例如I型 和II型糖尿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、严重烧伤和强直性肌营养不良中的作用。众所 周知IGF-I在肿瘤的维持中起作用，所以IGF-I的拮抗剂将对癌症治疗具有治疗价值。本公开涉及IGF-I的重组形式的鉴定，该形式具有改进的药代动力学(PK)和活性。新的IGF-I分子具有生物学活性，形成二聚体，并且具有改进的稳定 性。根据本发明的一个方面，提供了一种核酸分子，该核酸分子包含一种核酸序列，该 核酸序列编码具有胰岛素样生长因子的活性的多肽，所述多肽包含胰岛素样生长因子多肽 直接或者间接连接的胰岛素样生长因子受体的至少一个结合结构域。根据本发明的一个方面提供了一种融合多肽，该融合多肽包含胰岛素样生长因 子多肽或者其活性部分直接或者间接与胰岛素样生长因子多肽受体多肽的至少一个胰岛 素样生长因子多肽结合结构域连接的氨基酸序列。在本发明的优选实施方案中，所述多肽结合结构域包含富含亮氨酸的氨基酸基序 或者由富含亮氨酸的氨基酸基序组成。在本发明的优选实施方案中，所述富含亮氨酸的氨基酸基序包含SEQID NO 14的 氨基酸31-179或者由SEQ ID NO 14的氨基酸31-179组成。
在本发明的替代优选实施方案中，所述富含亮氨酸的氨基酸基序包含SEQ ID NO 14的氨基酸229-487或者由SEQ ID NO 14的氨基酸229-487组成。在本发明的进一步优选实施方案中，所述多肽包含至少一个纤维粘连蛋白 (fibronectirOlII结合结构域；优选地所述结构域包含SEQ ID NO :14的氨基酸残基 494-606或者由SEQ ID NO 14的氨基酸残基494-606组成。在本发明的优选实施方案中，胰岛素样生长因子多肽连接于所述富含亮氨酸的结 合结构域，其中所述胰岛素样生长因子多肽位于所述融合多肽中所述富含亮氨酸的结构域 的氨基末端。
在本发明的替代优选实施方案中，胰岛素样生长因子多肽连接于所述富含亮氨酸 的结合结构域，其中所述胰岛素样生长因子多肽位于所述融合多肽中所述富含亮氨酸的结 构域的羧基末端。在本发明的优选实施方案中，胰岛素样生长因子多肽连接于所述纤维粘连蛋白 III结合结构域，其中所述胰岛素样生长因子多肽位于所述融合多肽中所述纤维粘连蛋白 III结合结构域的氨基末端。在本发明的替代优选实施方案中，胰岛素样生长因子多肽连接于所述纤维粘连蛋 白III结合结构域，其中所述胰岛素样生长因子多肽位于所述融合多肽中所述纤维粘连蛋 白III结合结构域的羧基末端。在本发明的优选实施方案中，胰岛素样生长因子多肽由肽连接序列，优选地柔性 肽连接序列连接于胰岛素样生长因子受体多肽的富含亮氨酸的结构域。在本发明的优选实施方案中，所述肽连接分子包含至少一份拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0在本发明的优选实施方案中，所述肽连接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或者10份拷 贝的肽 Gly Gly Gly Gly Ser0在本发明的替代实施方案中，所述多肽不包含肽连接分子，且所述多肽是胰岛素 样生长因子多肽与胰岛素样生长因子受体多肽的富含亮氨酸的结合结构域的直接融合多 肽。根据本发明的一个方面，提供了一种核酸分子，包括选自以下的核酸序列i)SEQ ID NO 1所表示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 3所表示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 5所表示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 7所表示的核酸序列；v) SEQ ID NO 9所表示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 11所表示的核酸序列；或者包含如下核酸序列的核酸分子，该核酸序列在严谨性杂交条件下与SEQ ID NO :1、 3、5、7、9或者11杂交并编码具有胰岛素样生长因子调节活性的多肽。在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子编码具有激动剂活性的多肽。在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子编码具有拮抗剂活性的多肽。当两个互补的核酸分子形成相当数量的氢键彼此结合时，核酸分子的杂交就会发 生。杂交的严谨性会因为核酸分子周围的环境条件、杂交方法的性质、所用的核酸分子的组成和长度而变化。关于获得具体程度的严谨性所要求的杂交条件的计算在Sambrook等 人，Molecular Cloning :ALaboratory Manual (分子克隆实验手册)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor，NY,2001)；禾口 Tijssen，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic AcidProbes Part I，Chapter 2 (生物化学和分子生物学的实验技术-与核酸探针杂交，第I部分第2章) (Elsevier, New York, 1993)中讨论。Tm是指50%的核酸分子给定链与其互补链杂交时的 温度。以下是杂交条件的示例性设置，不意为限制驢細，謎(介Λ午辟Φ 90%_—性請歹丨丨棘)杂交5XSSC在65°C杂交16小时洗涤两次2 X SSC在室温(RT)进行，每次15分钟洗涤两次0· 5 X SSC在65°C进行，每次20分钟細，謎(介Λ午辟Φ 80%細一性請歹丨丨棘)杂交5X_6XSSC在 65°C _70°C杂交 16-20 小时洗涤两次2 X SSC在RT进行，每次5-20分钟洗涤两次1 X SSC在55°C -70°C进行，每次30分钟低經谢牛(介Λ午辟Φ 50%細一性請歹丨辦)杂交6XSSC在 RT_55°C杂交 16-20 小时洗涤最少两次2 X -3 X SSC在RT_55°C进行，每次20_30分钟在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 1所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO 1所表示的核酸序列组成。在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 3所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO :3所表示的核酸序列组成。在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 5所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO :5所表示的核酸序列组成。在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 7所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO :7所表示的核酸序列组成。在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 9所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO :9所表示的核酸序列组成。在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :11所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO 11所表示的核酸序列组成。根据本发明的一个方面，提供了由根据本发明的核酸编码的多肽。根据本发明的一个进一步的方面，提供了包含选自SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、 15、16、17、18、19或者20组成的组的氨基酸序列或者由选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、 15、16、17、18、19或者20组成的组的氨基酸序列组成的多肽。根据本发明的一个方面，提供了由两种多肽组成的同源二聚体，其中每种多肽包 括i)第一部分，包含胰岛素样生长因子或者其受体结合结构域，任选地由肽连接分 子连接到ii)第二部分，包含胰岛素样生长因子受体的至少一个胰岛素样生长因子结合结构域或者其部分。在本发明的优选实施方案中，所述同源二聚体包含两种包括SEQ IDN0:2、4、6、8、 10、12、15、16、17、18、19 或者 20 或者由 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、15、16、17、18、19 或者 20组成的多肽。根据本发明一个进一步的方面，提供了包含根据本发明的核酸分子的载体。在本发明的优选实施方案中，所述载体是适于表达根据本发明的核酸分子的表达载体。包含根据本发明的核酸的载体不需要包含启动子或者其它调节序列，尤其是在该 载体用于将核酸导入细胞来整合到基因组中进行稳定转染的时候。优选地，为了在宿主细 胞中转录，载体中的核酸可操作地连接合适的启动子或者其它调节元件。载体可以是双功 能表达载体，可以在多种宿主起作用。“启动子”是指在转录起始位点的上游，包含转录所需 要的所有调节区域的核苷酸序列。合适的启动子包括组成型启动子、组织特异性启动子、诱 导型启动子、发育型启动子或者用于在真核细胞或者原核细胞表达的其它启动子。“可操作 地连接”表示连接为同一核酸分子的一部分，对于将从启动子起始的转录合适地定位和定 向。可操作地连接到启动子的DNA是在启动子的“转录起始的调节下”。在优选实施方案中，所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子或者可调节的启 动子。根据本发明的一个进一步的方面，提供了转染或者转化有根据本发明的核酸分子 或者载体的细胞。优选地所述细胞是真核细胞。替代地所述细胞是原核细胞。在本发明的优选实施方案中，所述细胞选自下组真菌细胞(比如毕赤酵母属 (Pichia spp)、酵母菌属(Saccharomyces spp)、链孢霉属(Neurosporaspp))；昆虫细胞 (比如灰翅夜蛾属(Spodoptera spp))；哺乳动物细胞(比如COS细胞、CHO细胞)；植物细 胞。根据本发明的一个进一步的方面，提供了包含根据本发明的多肽并包含赋形剂或 者载体的药物组合物。在本发明的优选实施方案中，所述药物组合物组合有进一步的治疗剂。当给药时，本发明的药物组合物以药学上可接受的制剂给药。这些制剂通常可包 含制药学上可接受的浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体和任选地其它治疗剂。本发明的药物组合物可通过包括注射的任何常规路径给药。给药和施用可以是， 例如口服、静脉内、腹膜内、肌内、腔内、关节内、皮下、局部(眼睛、皮肤(比如膏状脂质可溶 插入物插入到皮肤或者粘膜)、经皮或者鼻内的。本发明的药物组合物以有效量给药。“有效量”是指单独或者与进一步剂量或协同 作用的药物联用时产生期望的反应的药物/组合物的量。这种反应可能仅包括暂时延缓疾 病的发展，当然更优选地包括永久性地停止疾病的发展。这可以通过常规方法监测或者按 照诊断方法监测。向受治疗者给药的药物组合物的剂量可以按照不同的参数来选择，特别是按照所 用的给药方式和受治疗者的状态(比如年纪、性别)。当给药时，本发明的药物组合物以药 学上可接受的量和药学上可接受的组合物来施加。当用作药物时，盐类应该是药学上可接受的；但药学上不可接受的盐类可方便地用于制备其药学上可接受的盐类，不排除在本发 明范围之外。这些药理学和药学上可接受的盐类包括但不限于从以下酸制备的盐类盐酸、 氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸和类似酸。药 学上可接受的盐类还可制备为碱金属盐类或者碱土金属盐类，比如钠盐、钾盐或钙盐。如果需要的话，药物组合物可以与药学上可接受的载体组合。本文所用的术语“药 学上可接受的载体”是指适合用于人体给药的一种或者多种相容的固态或者液态填充剂、 稀释剂、或包封物质。术语“载体”指的是自然产生的或者是合成的无机或者有机的成分， 活性成分与其混合有利于施用。药物组合物的成分还能够以不会产生大致上损害预期的药 效的相互作用的方式与本发明的分子共同混合，和互相共同混合。药物组合物可以含有合适的缓冲剂，包括乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和 磷酸盐。药物组合物还可以任选地含有合适的防腐剂，比如苯扎氯铵、三氯叔丁醇、对羟苯 甲酸酯、硫柳汞。药物组合物可以方便地以单位剂量形式存在，可以用药学上众所周知的任何方法 制备。所有的方法包括将活性剂与构成一种或多种辅助成分的载体组合的步骤。一般来 讲，药物组合物是如下制备的通过将活性化合物与液态载体、磨碎的固态载体或两者均一 地和紧密地组合，随后如果需要的话，将产品成型。适于口服给药的药物组合物可以制备为分散的单位，比如胶囊、片剂、锭剂，这些 剂型各含有预先确定量的活性化合物。其它组合物包括含水液态悬浮物和非含水液态悬浮 物，后者比如糖浆、酏剂或乳剂。适于肠胃外给药的药物组合物合适地包括无菌的含水或者非含水制剂，该制剂优 选地与接受者的血液等渗。这种制剂可以按照已知的方法选用合适的分散剂或湿润剂和悬 浮剂制备。无菌的可注射的制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或者溶剂中的无 菌的溶液或者悬浮液，比如1，3_ 丁二醇中的溶液。可采用的可以接受的溶剂包括水、林格 氏溶液和等渗的氯化钠溶液。除此以外，常规地采用无菌的不挥发油作为溶剂或者悬浮介 质。为此目的，任何性质温和的不挥发油都可以应用，包括合成的单甘油酯或者二甘油酯。 除此以外，脂肪酸比如油酸可以用来制备注射制剂。适于口服、皮下、静脉内、肌内等给药方 式的载体制剂可参考Remington' sPharmaceutical Sciences (雷明登氏制药科学)，Mack Publishing Co. , Easton, ΡΑ。根据本发明的进一步的方面，提供了治疗患有与严重的原发性胰岛素样生长因子 缺乏相关的疾病或者疾患的人类受治疗者的方法，包括给药有效量的至少一种根据本发明 的多肽。在本发明的优选方法中，所述严重的原发性缺乏是拉伦侏儒症。在本发明的进一步优选方法中，所述疾病是对于生长激素治疗不响应的疾病。在本发明的进一步优选方法中，所述疾病是I型糖尿病。在本发明的替代优选方法中，所述疾病是II型糖尿病。在本发明的进一步优选方法中，所述疾病是肌萎缩性脊髓侧索硬化症。在本发明的进一步优选方法中，所述疾病是强直性肌营养不良。
在本发明的进一步优选方法中，所述疾患是严重烧伤。 根据本发明的进一步方面，提供了一种治疗患有癌症患者的人类受治疗者的方法，包括给药有效量的根据本发明的多肽拮抗剂。本文所用的术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞，即以细胞的快速增殖生长为特征的一种非正常的状态或情况。该术语意为包括所有类型的癌性生长和致癌过程、转 移的组织或者恶性转化的细胞、组织或器官，不论组织病理学的类型或者侵袭的阶段。术语 “癌症”包括各种器官系统的恶性肿瘤，比如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴组织、胃肠、生殖泌 尿道的癌，也包括腺癌，腺癌包括诸如大多数的结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿 瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌。术语“腺癌”是领域公认的，指上皮或者内分泌组织的 恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分 泌系统癌、和黑素瘤。示例性癌包括从宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢组织形成 的癌。术语“癌”还包括癌肉瘤，如包括癌性组织和肉瘤样组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是 指癌来源于腺体组织或者其中肿瘤细胞形成可辨别的腺体结构。术语“肉瘤”是领域公认 的，指来源于间充质的恶性肿瘤。在本发明的优选方法中，所述多肽静脉内给药。在本发明的替代优选方法中，所述多肽皮下给药。在本发明的进一步优选方法中，所述多肽以每两天的间隔给药；优选地所述多肽 以每周、两周或者每月的间隔给药。根据本发明的进一步的方面，提供了结合根据本发明的多肽或者二聚体的单克隆 抗体。优选地，所述单克隆抗体是结合多肽或者二聚体但不特异性地单独结合胰岛素样 生长因子或者胰岛素样生长因子受体的抗体。该单克隆抗体结合本发明的多肽或者包含本发明的多肽的二聚体呈递的构象抗 原。在本发明一个进一步的方面，提供了制备生产根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤 细胞系的方法，包括如下步骤i)用包含至少一种根据本发明的多肽或者其片段的免疫原对免疫活性的哺乳动 物进行免疫；ii)将所述免疫后免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而形成杂 交瘤细胞；iii)筛选步骤(ii)中所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体对(i)中所述多肽的结 合活性；iv)培养所述杂交瘤细胞使其增殖和/或分泌所述单克隆抗体；并ν)从培养物的上清液回收所述单克隆抗体。优选地，所述免疫活性的哺乳动物是小鼠。可选地，所述免疫活性的哺乳动物是大鼠。用杂交瘤细胞来产生单克隆抗体是领域公知的。产生单克隆抗体的方法由 Kohler 和 Milstein 在 Nature 256. 495-497 (1975)公开，也由 Donillard 和 Hoffman 在 Schwartz，1981 编著的 Immunology V. II (免疫学第七版)摘要中的 “Basic Facts about Hybridomas (关于杂交瘤的基本事实)”公开，通过引用并入。根据本发明进一步的方面，提供了根据本发明的方法获得的或者可获得的杂交瘤细胞系。根据本发明进一步的方面，提供了检测生物样品中的根据本发明的多肽的诊断检 测方法，包括以下步骤i)提供分离的待检的样品；ii)使所述样品接触结合根据本发明的多肽或者二聚体的配体；并iii)检测所述样品中所述配体的结合。在本发明的优选实施方案中，所述配体是抗体；优选地是单克隆抗体。本申请中遍及说明书和权利要求书的用语“包含(comprise) ”和“含有 (contain) ”和它们的衍生词汇，比如“包含(comprising) ”和“包含(comprises) ”表示“包 括但并不局限于”，而且并不意为(和并不)排除其它部分、添加物、组分、整体或者步骤。除非上下文另外地要求，否则本申请中遍及说明书和权利要求书中的单数形式涵 盖复数形式。特别是，除非上下文另外地要求，否则当使用不定冠词时，该描述应理解为涵 盖单数形式和复数形式。除非与其不相容，否则结合本发明的具体方面、实施方案或实施例描述的性质、整 体、特征、化合物、化学部分或者基团应理解为可应用于本文描述的任何其它方面、实施方 案或实施例。本发明的实施方案将仅以示例的方式参考以下图来描述表1概括了融合蛋白的命名；图Ia表示LR 5A1的核酸序列，图Ib表示LR 5A1的氨基酸序列；图2a表示LR 5B1的核酸序列，图2b表示LR 5B1的氨基酸序列；图3a表示LR 5C1的核酸序列，图3b表示LR 5C1的氨基酸序列；图4a表示LR 5D1的核酸序列，图4b表示LR 5D1的氨基酸序列；图5a表示LR 5E1的核酸序列，图5b表示LR 5E1的氨基酸序列；图6a表示LR 5F1的核酸序列，图6b表示LR 5F1的氨基酸序列；图7表示人类IGF-IA的氨基酸序列；图8表示人类IGF-I受体的氨基酸序列；图9PCR用于产生由侧翼为合适的限制性酶切位点的目标基因组成的DNA(限制性酶切位点包含在引物R1-4中)。b)将PCR产物连接到合适的载体的连接区域的各一侧。 c)随后修饰构建体以引入正确的连接序列，该序列不含任何不需要的序列(即，非自身的 限制性酶切位点)；

图10寡核苷酸设计为形成具有独特重叠区的部分双链区域，当退火和加工时该 寡核苷酸将编码将退火到受体和配体的带有侧翼区的连接序列。b)用“megaprimer”和末 端引物(Rl和R2)进行PCR方法来产生LR-融合基因。Rl和R2引物设计为引入有用的侧 翼限制性酶切位点用于连接到目标载体；图IlA展示了 CHO细胞表达的5A1的蛋白质印迹结果。在DTT存在下如所述地制 备样品。泳道1 分子量标记，泳道2 :5A1(从稳定细胞系100X浓缩的培养基)，泳道3 5A1的瞬时转染(DNA :fugene 6按照3:2)，泳道4 :5A1的瞬时转染(DNA :fugene 6按照 3:1)，泳道5 :5A1的瞬时转染(DNA+TranslT)，泳道6 载体对照(从lB7stop稳定细胞系 100X浓缩的培养基)，泳道7 阳性对照，IOOng rh-IGF-1。图IlB 展示了用5A1以较长曝光时间再次进行探测的蛋白质印迹结果泳道1 标准物；泳道2 :5A1(从稳定细胞系IOOX 浓缩的培养基)，5A1作为75和40kDa的主要的两条带分离出。非糖基化的分子量大约为 28. 4kDa, IGF-I对照蛋白分子量为17kDa。图IlC展示了 5A1培养基样品在非还原条件下 的电泳结果。大多数5A1电泳到250kDa标记之上，表示该分子可能通过二硫键连接；图12A表示重组IGF-I刺激在1 %胎牛血清中生长3天后的MG63细胞的酸性磷 酸酶活性的生物学活性；图12B表示重组IGF-I刺激在胎牛血清中生长4天后的MG63 细胞的酸性磷酸酶活性的生物学活性；图12C表示重组IGF-I刺激在2mg/ml BSA中生长4 天后的MG63细胞的酸性磷酸酶活性的生物学活性；图12D表示重组IGF-I刺激在胎牛 血清中生长4天后的NIH3T3细胞的酸性磷酸酶活性的生物学活性；且图13A展示了衍生自不表达5A1的细胞的对照培养基和衍生自表达5A1的细胞的 培养基经连续稀释后对在1 %胎牛血清中生长3天后的MG63细胞的酸性磷酸酶活性的作用 的比较；图13B展示了衍生自不表达5A1的细胞的对照培养基和衍生自表达5A1的细胞的 培养基经连续稀释后对在胎牛血清中生长4天后的MG63细胞的酸性磷酸酶活性的作用 的比较；图13C展示了衍生自不表达5A1的细胞的对照培养基和衍生自表达5A1的细胞的 培养基经连续稀释后对在2mg/ml BSA中生长4天后的MG63细胞的酸性磷酸酶活性的作用 的比较；图13D展示了衍生自不表达5A1的细胞的对照培养基和衍生自表达5A1的细胞的 培养基经连续稀释后对在胎牛血清中生长4天后的OTH3T3细胞的酸性磷酸酶活性的作 用的比较。材料和方法
体外检测用于检测和评价IGF-I的活性的体外检测是本领域已知的。比如Pietrzkowski 等(Molecular and Cellular Biology (分子和细胞生物学)(1992)第 12 卷，no 9 P3883-3889)阐述了在BALB 3T3细胞中表达IGF-I受体，并且暴露于IGF-I导致刺激细胞 增殖和IGF-I受体的自磷酸化。还参见Flier等人(PNAS(1986)83 :664_668)，阐述了用拮 抗性单克隆抗体来阻断IGF-I引起的IGF-I受体激活。体内检测各种IGF-I的动物模型都可以用来检测IGF-I的活性。比如Lembo等人 (J. Clinical Investigation (1999) 98，2648-2655)阐述了一种 IGF-I 突变小鼠携带突 变的等位基因导致野生型IGF-I水平有30%的降低，但是小鼠可以存活到成年。Liu等 人(Cell(1993) 75 :59_72)和 Powell-Braxton 等人(Genes and Development(1993)7 2609-2617)阐述了纯合小鼠表现出严重的胚胎和产后生长缺陷。免疫检测测量IGF-I对多克隆抗体和单克隆抗体的结合的免疫测定是本领域已知的。可 购买获得的IGF-I抗体可用来检测样品中的IGF-1，也可用于竞争抑制研究。比如参见 http//www, abeam, com/index, html，Abeam PLC0融合蛋白的重组生产融合蛋白的组成部分由PCR产生，使用的引物设计为能够与配体或者受体退火并 且为了克隆到目标载体引入合适的限制性酶切位点(图9a)。用于PCR的模板包含目标基 因，从IMAGE克隆、cDNA文库或者从定制合成的基因获得。合成带有合适的侧翼限制性酶切位点的配体和受体基因后，随后将其连接到目标载体中连接区域的各一侧(图9b)。然后 修饰构建体使其含有不带有侧翼限制性酶切位点的正确的连接序列，这是通过在连接区域 的各一侧的两个独特限制性酶切位点之间插入定制合成长度的DNA，通过ssDNA修饰技术 来突变连接区域，和通过插入引物二聚体/多聚体到合适的限制性酶切位点间或者PCR修 饰来实现的(图9c)。可选地，设计为退火到所选配体或者受体区域的带有侧翼序列的连接序列，通过 产生寡核苷酸二聚体来初始合成，对其加工来产生双链DNA(图IOa)。然后使用连接序列作 为“megaprimer”来进行PCR，引物设计为针对“megaprimer”退火到的配体和受体的相对末 端，受体和配体作为模板。末端引物设计为带有合适的限制性酶切位点用于连接到选择的 表达载体中(图IOb)。
融合蛋白的表汰和纯化在合适的表达系统(比如哺乳动物CHO细胞、大肠杆菌)进行表达，表达取决于在 其中产生LR融合基因的载体。随后用多种方法来分析表达，包括SDS-PAGE、非变性PAGE、 蛋白质印迹法、ELISA的一种或者多种。达到合适的表达水平后，以更大规模表达LR融合蛋白以产生足够用于纯化和接 下来的分析的蛋白。纯化采用合适组合的一种或者多种层析过程，比如离子交换层析、疏水 相互作用层析、硫酸铵沉淀、凝胶过滤、尺寸排阻和/或者亲和层析(使用镍钴树脂、固定化 的抗体树脂和/或者固定化的配体/受体树脂)。使用很多方法来分析纯化的蛋白，可包括 Bradford测定、SDS-PAGE、非变性PAGE、蛋白质印迹法、ELISA的一种或者多种。LR融合蛋白的表征用变性PAGE、非变性PAGE凝胶和蛋白质印迹法来分析融合多肽，蛋白质印迹法以 对LR融合蛋白非构象敏感性的抗体来进行。非变性溶液状态的分子量信息可从诸如使用 Superose G200分析柱的尺寸排阻层析和分析性超速离心等技术获得。数据统计如果两组数据的方差是正常分布则采用Student检验来比较，如果不是正常分布 则采用Student-Satterthwaite检验。数据分布采用F检验来检验。采用单因素ANOVA 来比较3组或者更多组的平均值，如果显著性水平的ρ值小于0. 05，则用Durmett检验进 行单独比较。所有的统计学检验在5%显著性水平均是双侧检验，对漏测值不进行填补 (imputation)。嵌合克隆的构建所有的克隆均采用限制性内切酶Nhel/HindlII连接到哺乳动物表达质粒 PSecTag-Iink中。为了能够有效分泌到细胞培养基中，将克隆连接到人类IGF-I的分泌信 号。5A1的全基因是使用基因合成克隆的，并克隆到哺乳动物表达载体pSecTag-link中形 成 pIGFsecTag_5Alο哺乳动物稳定表达应用修饰的Invitrogen公司的载体pSecTag-V5/FRT_Hist建立哺乳动物表达系 统。InvitroRen 公司的 Flp-In 系统,这个系统允许为了高表达快速地产生克隆到宿主基因组中特定位点中的稳定的克隆。分泌的蛋白和在胞质表达的蛋白都可以用这个系统。Flp-In宿主细胞系(flp-In CHO)具有位于转录活跃的基因组位点的单个Flp重组酶目标(FRT)位点。通过共同转染载 体(含有FRT靶位点)和pOG44 (瞬时表达f Ip重组酶的质粒)到Flp-in细胞系中得到稳 定细胞系。用潮霉素B进行选择。对于克隆的选择是不必要的，因为DNA的整合是定向的。 Flp-In细胞系的培养使用基本的细胞培养技术按照制造商说明书进行。用Fugene-6 稳定转染 CHO Flp-In 细胞在转染进行的前一天，将CHO Flp-In细胞以6X 105/100mm皮氏培 养皿接种到包含 10% (ν/ν)胎牛血清、青霉素/链霉素和4mM L-谷氨酰胺的总体积IOml的Hams F12 培养基。第二天，将570μ1无血清(无抗生素)培养基加入到1.5ml聚丙烯管中。然后 加入30 μ 1 fugene-6,轻轻摇晃混合。对每种转染，建立组合2 μ g感兴趣的质粒和18 μ g pOG44(包含对于质粒正确整合到宿主基因组必需的重组酶的质粒)的单独的质粒混合物。 对照平板不接受质粒。通过轻轻摇晃与fugene-6混合，在室温放置15分钟，随后逐滴加到 包含F12培养基+10% FCS中CHO Flp-In细胞的每个皮氏培养皿表面。轻轻摇晃平板以确 保充分混合，在37°C、5% C02的条件下放置24小时。第二天，更换培养基为含有600 μ g/ ml的潮霉素B的选择培养基。常规地将细胞保持为60%汇合或者更少汇合。将细胞保持 在600 μ g/ml潮霉素B存在下生长，直到对照平板细胞(未转染的细胞)死亡(S卩，没有潮 霉素抗性)。稳定CHO细胞系的试验表达将表达目标蛋白的汇合的CHO Flp-In细胞系培养在75cm2的培养瓶的无血清培 养基中大约3-4天，此时取样并用丙酮沉淀来浓缩样品。将样品与等体积的Iaemmli上样 缓冲液混合，分别加入或者不加入25mM DTT,煮沸5分钟。样品用SDS-PAGE分析，并转移 到PVDF膜上。在PBS-0.05% (v/v) Tween 20中的5% (w/v)乳蛋白中封闭后，用特异性抗 IGF-I抗体和辣根过氧化物酶(HRP)共轭的二抗进行样品检测。用HRP检测试剂盒在感光 胶片上通过化学发光显影。瞬时转染的试验表达将CHO Flp-In细胞以0. 25 X IO6细胞/孔接种在6孔板中的终体积2ml培 养基(DMEM、F12、10% FCS+P/S+L-谷氨酰胺+Zeocin)。放置细胞以生长过夜。然后用 TranslT-CHO试剂(Mirus)或者fugene-6按照表1中指定的具体反应物比例转染细胞。对 照转染以lB7stop (包含嵌合分子的GH)建立。简单来讲，如果用TranslT试剂，对每个转 染反应将200 μ 1无血清培养基(OPTI MEM)加入到1. 5ml eppendorf管中，随后加入2 μ g DNA。将管在室温放置15分钟。随后加入1 μ 1 CHO Mojo试剂，混合并放置另外15分钟。 将培养基换成无血清培养基，将转染混合物用移液管逐滴加入到适当孔的表面。简单来讲， 如果用Fugene-6试剂，对每个转染反应将94 μ 1无血清培养基(0ΡΤΙ MEM)加入到1. 5ml eppendorf管中，随后加入2 μ gDNA。将管在室温放置15分钟。将转染混合物用移液管逐 滴加入到含有无血清培养基的适当孔的表面。将所有平板在37°C、5% C02放置2-3天。IGF-I生物活性测定测定培养基MG63细胞EMEM加入10% FCS、青霉素/链霉素、5mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸 (NEAA)=完全 EMEM。NIH 3T3 细胞DMEM+glutamax (4. 5g/L 葡萄糖)+10% FCS、青霉素 /链霉素、2mM丙酮酸钠、5mM L-谷氨酰胺=完全DMEM。MG63 细胞EMEM (Gibco)加入 2mg/ml BSA 或者 1 % FCS、5mML_ 谷氨酰胺、青霉素 / 链霉素、NEAA。NIH 3T3 细胞:DMEM+glutamax (Gibco ；Cat#61956，Lot#357700)+1 % FCS (或 者2mg/ml BSA)、5mML_谷氨酰胺(Gibco)、青霉素/链霉素(Gibco)、2mM丙酮酸钠(Gibco)。测定方法1.对于测定用TE处理细胞并计数。调整密度到50 μ 1 DMEM+1 % FCS (或者2mg/ ml BSA)中含有 5X103细胞(1 X IO5细胞/ml)。铺板到96孔板。2.在DMEM中(加入1 % FCS或者2mg/ml BSA)制备一系列的IGF-1稀释液，向含 有细胞的各孔加入50 μ 1每种稀释液(O-IOOng/孔)。同样处理培养基样品。
3.在IGF-I或者待检测的样品存在下将细胞在37°C、5% C02培养3和4天。4.对于测定从各孔除去培养基，每孔用200 μ 1 PBS缓冲液漂洗一次。5.对碱性磷酸酶的测定在测定缓冲液中使用ρΝΡΡ。每孔加入100 μ 1。6.在37°C培养2小时。7.每孔加入10 μ 1 IM NaOH终止反应。8.在室温培养平板5-20分钟以允许显色。9.在微孔板读板器记录每孔的A405nm。舰1.添加底物的测定培养基(没有生物活性因子)确定非酶水解底物的量。从每 个实验值中减去这些值。2.仅添加底物的细胞(没有生物活性因子)这代表在生长因子不存在时细胞能 够生长的量。实施例检测细胞系MG63和NIH 3T3在IGF-1或者是嵌合体(5A1)存在时的增殖能力。 这一检测基于使用底物磷酸对硝基苯酯来测定内源的酸性磷酸酶活性。MG63细胞(人类 骨肉瘤细胞系Cat#86051601，lot#05F008, ECACC)，NIH3T3细胞系，小鼠成纤维细胞细胞 系(来自 Simon Smith, ARCBioserv, Sheffield University,管子日期1993 年 6 月 24 日)。MG63和NIH 3T3细胞对重组IGF-I的存在响应良好，获得良好的剂量响应曲线；参见 图12A、12B、12C和12D。这些数据显示，在5A1培养基存在时细胞增殖，在较低的稀释度产 生浅的剂量响应(shallow dose response) 0 5A1培养基的样品一致地产生比对照培养基 高程度的增殖，参见图13A、13B、13C或者13D。
权利要求
一种核酸分子，该核酸分子包含一种核酸序列，该核酸序列编码具有胰岛素样生长因子的活性的多肽，所述多肽包含胰岛素样生长因子多肽直接或者间接连接的胰岛素样生长因子受体的至少一个结合结构域。
2.一种融合多肽，该融合多肽包含胰岛素样生长因子多肽或者其活性部分直接或者 间接与胰岛素样生长因子多肽受体多肽的至少一个胰岛素样生长因子多肽结合结构域连 接的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的融合多肽，其中所述多肽结合结构域包含富含亮氨酸的氨基酸基序。
4.根据权利要求3所述的融合多肽，其中所述富含亮氨酸的氨基酸基序包含SEQID NO 14的氨基酸31-179。
5.根据权利要求2或者3所述的融合多肽，其中所述富含亮氨酸的氨基酸基序包含SEQ ID NO 14 的氨基酸 229-487。
6.根据权利要求3-5任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含至少一个纤维粘连蛋 白III结合结构域。
7.根据权利要求6所述的融合多肽，其中优选地所述结构域包含SEQIDNO: 14的氨基 酸残基494-606。
8.根据权利要求2-7任一项所述的融合多肽，其中所述胰岛素样生长因子多肽连接于 所述富含亮氨酸的结合结构域，其中所述胰岛素样生长因子多肽位于所述融合多肽中所述 富含亮氨酸的结构域的氨基末端。
9.根据权利要求2-7任一项所述的融合多肽，其中所述胰岛素样生长因子多肽连接于 所述富含亮氨酸的结合结构域，其中所述胰岛素样生长因子多肽位于所述融合多肽中所述 富含亮氨酸的结构域的羧基末端。
10.根据权利要求2-9任一项所述的融合多肽，其中所述胰岛素样生长因子多肽连接 于所述纤维粘连蛋白III结合结构域，其中所述胰岛素样生长因子多肽位于所述融合多肽 中所述纤维粘连蛋白III结合结构域的氨基末端。
11.根据权利要求2-9任一项所述的融合多肽，其中所述胰岛素样生长因子多肽连接 于所述纤维粘连蛋白III结合结构域，其中所述胰岛素样生长因子多肽位于所述融合多肽 中所述纤维粘连蛋白III结合结构域的羧基末端。
12.根据权利要求2-11任一项所述的融合多肽，其中所述胰岛素样生长因子多肽由肽 连接序列连接于所述胰岛素样生长因子受体多肽的所述结合结构域。
13.根据权利要求12所述的融合多肽，其中所述肽连接分子包含至少一份拷贝的肽 Gly Gly Gly Gly Ser0
14.根据权利要求13所述的融合多肽，其中所述肽连接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或 者10份拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0
15.根据权利要求2-11任一项所述的融合多肽，其中所述多肽不包含肽连接分子，且 所述多肽是所述胰岛素样生长因子多肽与所述胰岛素样生长因子受体多肽的所述结合结 构域的直接融合多肽。
16.一种核酸分子，包括选自以下的核酸序列i)SEQ ID NO 1所表示的核酸序列；ii)SEQID NO 3所表示的核酸序列；iii)SEQID NO 5所表示的核酸序列；iv)SEQ ID NO 7所表示的核酸序列；v)SEQ ID NO 9所表示的核酸序列；vi)SEQ ID NO 11所表示的核酸序列；或者包含如下核酸序列的核酸分子，该核酸序列在严谨性杂交条件下与SEQ ID N0:l、3、5、 7、9或者11杂交并编码具有胰岛素样生长因子调节活性的多肽。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有激动剂活性的多肽。
18.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有拮抗剂活性的多肽。
19.根据权利要求16-18任一项所述的核酸分子，包含SEQID NO :1所表示的核酸序列。
20.根据权利要求16-18任一项所述的核酸分子，包含SEQID NO :3所表示的核酸序列。
21.根据权利要求16-18任一项所述的核酸分子，包含SEQID NO :5所表示的核酸序列。
22.根据权利要求16-18任一项所述的核酸分子，包含SEQID NO :7所表示的核酸序列。
23.根据权利要求16-18任一项所述的核酸分子，包含SEQID NO :9所表示的核酸序列。
24.根据权利要求16-18任一项所述的核酸分子，包含SEQID NO :11所表示的核酸序列。
25.一种多肽，由根据权利要求1或者16-24任一项的核酸编码。
26.一种多肽，包含选自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、15、16、17、18、19 或者 20 组成的 组的氨基酸序列或者由选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、15、16、17、18、19或者20组成的组的氨基酸序列组成。
27.一种由两种多肽组成的同源二聚体，其中每种所述多肽包含i)第一部分，包含胰岛素样生长因子或者其受体结合结构域，任选地由肽连接分子连接到 )第二部分，包含胰岛素样生长因子受体的至少一个胰岛素样生长因子结合结构域 或者其部分。
28.根据权利要求27所述的同源二聚体，其中所述同源二聚体包含两种包括SEQID NO :2、4、6、8、10、12、15、16、17、18、19 或者 20 的多肽。
29.—种载体，包含根据权利要求1或者16-24任一项的核酸分子。
30.一种细胞，是转染或者转化有根据权利要求1、16-24或者29任一项的核酸分子或 者载体的细胞。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
32.根据权利要求30所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
33.一种药物组合物，包含根据权利要求2-15、25或者26任一项的多肽，并包含赋形剂 或者载体。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述组合物组合有进一步的治疗剂。
35.一种治疗患有与严重的原发性胰岛素样生长因子缺乏相关的疾病或疾患的人类受 治疗者的方法，包括给药有效量的至少一种根据权利要求2-15、25或者26任一项的多肽。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述严重的原发性缺乏是拉伦侏儒症。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是对于生长激素治疗不响应的疾病。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是I型糖尿病。
39.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是II型糖尿病。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是强直性肌营养不良。
42.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾患是严重烧伤。
43.一种治疗患有癌症的人类受治疗者的方法，包括给药有效量的根据权利要求 2-15,25或者26任一项的多肽拮抗剂。
44.根据权利要求35-43任一项所述的方法，其中所述多肽静脉内给药。
45.根据权利要求35-43任一项所述的方法，其中所述多肽皮下给药。
46.根据权利要求35-45任一项所述的方法，其中所述多肽以每两天的间隔给药。
47.根据权利要求35-45任一项所述的方法，其中所述多肽以每周的间隔给药。
48.根据权利要求35-45任一项所述的方法，其中所述多肽以每两周的间隔给药。
49.根据权利要求35-45任一项所述的方法，其中所述多肽以每月的间隔给药。
50.一种单克隆抗体，该单克隆抗体结合根据权利要求2-15、25或者26或者27或者 28任一项的多肽或者二聚体。
51.根据权利要求50所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是结合所述多肽或者二 聚体但不特异性地单独结合胰岛素样生长因子或者胰岛素样生长因子受体的抗体。
52.一种制备产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，包括如下步骤 i)用包含至少一种根据权利要求2-15或者25或者26或者27或者28任一项的多肽或者二聚体的免疫原对免疫活性的哺乳动物进行免疫； )将所述免疫后免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而形成杂交瘤 细胞；iii)筛选步骤(ii)中所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体对(i)中所述多肽的结合活性；iv)培养所述杂交瘤细胞使其增殖和/或分泌所述单克隆抗体；并 ν)从培养物的上清液回收所述单克隆抗体。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述免疫活性的哺乳动物是小鼠或者大鼠。
54.一种杂交瘤细胞系，是根据权利要求52或者53的方法获得的或者可获得的杂交瘤 细胞系。
55.一种检测生物样品中的根据本发明的多肽的诊断检测方法，包括以下步骤 i)提供分离的待检的样品； )使所述样品接触结合根据权利要求2-15、25或者26或者27或者28任一项的多肽或者二聚体的配体；并ii)检测所述样品中所述配体的结合。
56.根据权利要求55所述的检测方法，其中所述配体是抗体。
57.根据权利要求56所述的检测方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
全文摘要
本公开涉及胰岛素样生长因子融合多肽；编码所述多肽的核酸分子和使用所述多肽的治疗方法。
文档编号C07K14/65GK101827859SQ200880110332
公开日2010年9月8日 申请日期2008年8月5日 优先权日2007年8月6日
发明者乔恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·罗斯 申请人:埃斯特瑞恩有限公司