。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0028] 一、材料和试剂
[0029] 材料：细胞因子TNF-α细胞毒作用的参考品-重组人TNF-α蛋白（Invitrogen， Cat. No. PHC3013)，对参考品进行稀释分别得到不同效价水平（50 %，75 %，100 %，125 %， 150% )的 TNF- α 供试品，放线菌素 D-ActD (MedChemExpress，Cat. No. HY-17559)。
[0030] 试剂：染色液 MTS (Promega，Cat. No. G3581)，MEM 培养基（HyClone，Cat-No. SH30024. 01B) ，胰蛋白酶 （GIBC0，Cat. No. 25200-072) ，FBS(GIBCO，Cat. No. 10099-141) 。
[0031] 溶液配制：
[0032] MEM完全培养基：取450ml MEM基础培养基，加入50ml FBS，配成500ml含FBS 10%的MEM完全培养基，2-8 °C避光保存。
[0033] 放线菌素 D母液：取1瓶放线菌素 D (5mg/瓶），加入1ml DMSO溶解，混匀，制成 5mg/ml放线菌素 D母液，分装，-15t〇-25°C避光保存。
[0034] 细胞株：L929小鼠成纤维细胞株（购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞 库，目录号：GNM28)
[0035] 二、检测方法步骤
[0036] 1)细胞铺板：取对数生长期的L929细胞经胰蛋白酶消化后用MEM完全培养基制 成单细胞悬液。计数，并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度至3. 0-5. OX IO5个/ml，以 50 μ 1/孔加入96孔细胞培养板中。空白对照孔则以50 μ 1/孔加入MEM完全培养基。完成 后将细胞培养板置于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养23-25h，使细胞贴壁。
[0037] 2)参考品及供试品稀释：取MEM基础培养基、FBS和放线菌素 D(ActD)母液制备含 2% FBSU μ g/mL的MEM分析培养基作为样品稀释液，取参考品及供试品，根据标示浓度， 用样品稀释液进行稀释至合适浓度，浓度范围是20ng/mL-5. lXl(T5ng/mL。
[0038] 3)加样：取贴壁后的细胞培养板，接着将稀释好的参考品及供试品以50 μ 1/孔依 次加入铺好细胞的细胞培养板中，空白对照孔则以50 μ 1/孔加入样品稀释液，2-3复孔。完 成后将细胞培养板放置于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养16-18h。
[0039] 4)显色：采用MTS显色体系分别对细胞培养板中参考品孔，供试品孔，空白对照孔 中以20 μ 1/孔加入MTS。完成后将细胞培养板放置于37°C，5%二氧化碳培养箱中继续孵 育 I. 5-2. 5h。
[0040] 5)读数：取出细胞培养板混勾，放入酶标仪，以650nm为参比波长，在490nm下测 定参考品孔，供试品孔及空白对照孔的OD49ch65ci，记录测定结果。
[0041] 6)结果分析：用参考品孔、供试品孔OD值与加药浓度的量效关系进行4参数拟 合，确定参考品与供试品的EC 5tl值，曲线拟合常数R2,复孔CV%。按照下列公式计算供试品 的细胞毒生物活性：
[0042]
【主权项】
1. 一种评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，包括下列步骤： 步骤（1):取对数生长期表达TNF-a受体的细胞经酶消化后，用完全培养基制成细胞 悬液，计数并计算所述的细胞悬液中的细胞密度及活率，并调整活细胞密度为nXIO5个/ ml，得到调整后的细胞悬液； 步骤（2):将所述的调整后的细胞悬液等体积加入细胞培养板的孔中，同时设立空白 对照孔，所述的空白对照孔被加入等体积所述的完全培养基，然后将所述的细胞培养板置 于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养23-25h，得到第一细胞培养板； 步骤（3):取基础培养基、FBS、放线菌数D，配置成含FBS、放线菌数D浓度的样品稀释 液； 步骤（4):取参考品及供试品，分别用所述的样品稀释液进行稀释，得到稀释浓度范围 的参考品、供试品溶液； 步骤（5):取步骤（2)中的所述的第一细胞培养板，将所述的稀释浓度的参考品、供试 品以等体积依次加入所述的第一细胞培养板的孔中，所述的空白对照孔则加入等体积的样 品稀释液，得到第二细胞培养板； 步骤（6):将所述的第二细胞培养板放置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养16-18h， 得到第三细胞培养板； 步骤（7):采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对所述的第三细胞培养板进行显色 反应； 步骤（8):所述的显色反应完成后，测定所述的显色反应的结果，并根据测定结果计算 供试品的细胞毒生物活性。
2. 如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，其特征在于， 所述n= 3-5。
3. 如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，其特征在于， 所述的对数生长期表达TNF-a受体的细胞是小鼠成纤维细胞L929。
4. 如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，其特征在于， 所述的完全培养基是含10%FBS的MEM完全培养基。
5. 如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，其特征在于， 所述的样品稀释液是含2%FBS、Iyg/mL放线菌数D的MEM分析培养基。
6. 如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，其特征在于， 步骤（4)中的所述稀释是用样品稀释液制备参考品及供试品溶液，所述的参考品及供试品 溶液的浓度范围是20ng/mL-5.IXKT5ng/mL。
7. 如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，其特征在于， 在步骤（7)中，所述的检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测 体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系。
8. 如权利要求7所述的评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，其特征在于， 所述的四唑类化合物为MTT、MTS或CCK-8。
9. 如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-a的生物活性体外检测方法，其特征在于， 所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于细胞因子TNF-α的细胞毒性作用评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法。本发明公开了一种评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法，该方法操作简单，不需要使用十分昂贵的材料与仪器设备，完成方法验证，完全满足方法准确度、精密度及耐用性等方面的要求，其活性检测范围达到50％-150％，重复性及中间精密度检测结果RSD均小于10％，且实验4参数拟合曲线的拟合常数R2均大于0.99，双复孔的CV％均小于15％。因此能够快速、准确、高效的对针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性进行检测。此外，本发明实验方法稳定且易于操作，完全能够满足推广以及高通量操作，满足进行基于细胞因子TNF-α细胞毒性作用的细胞因子TNF-α生物活性检测及其稳定性研究的需要。
【IPC分类】C12Q1-02
【公开号】CN104726531
【申请号】CN201510163674
【发明人】王少雄, 张宵, 吕品, 刘丹莉
【申请人】上海博威生物医药有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月8日