一种快速定性检测红莲型细胞质的方法

专利名称：一种快速定性检测红莲型细胞质的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用分子标记检测技术领域，更具体涉及一种快速定性检测水稻种质资源中红莲型配子体细胞质的方法，适用于各种水稻栽培种、农家种和野生稻等水稻的配子体细胞质的筛选。
背景技术：
植物在漫长的进化过程中通过自然突变或重组在细胞内积累了大量的变异，从而导致同一种内不同株系或品系的差异。这种差异在遗传水平即表现为彼此间某些DNA片段的不同。当这种变异与某一特定的基因紧密连锁时，即可作为该基因的特有的分子标签。如果将这些DNA片段通过体外扩增、电泳、显色，就会形成人们肉眼可见的具有不同大小的带型。这些不同品系间具有相对差异的带型即我们通常所说的分子标记，它对某一个品种而言，具有唯一性。利用分子标记进行品种选择或品种鉴定是当前植物生物技术育种的主要内容。它具有准确、快速、不受季节限制等优点，因而在生产中被广为采用。
分子标记辅助选择育种是现代生物技术与传统的育种技术相结合的产物，它使传统遗传育种学中粗放、经验型的育种技术向现代精细、定向选择转变，使育种变得更加具有可操作性。如果我们知道某一标签的DNA序列，那么就可以通过简单的PCR扩增技术或者RFLP/AFLP技术，跟踪特定的有利基因。由于分子标记具有唯一性，而且可借助PCR技术等方法，具有操作非常简单、结果可靠、效率高、不依赖表型等优点，在遗传育种上已被广泛应用，具有非常广阔的应用前景。
杨子贤等结合分子标记辅助选择将水稻抗白叶枯基因Xa21和Bt基因同时倒入9311中，在BC3F3家系中筛到8个含纯合的Xa21和Bt基因，其中两个与9311核背景具有90％的相似率，并表现出很高的白叶枯和螟虫抗性(杨子贤，姜恭好，徐才国，何予卿。利用分子标记辅助选择改良9311对白叶枯病和螟虫的抗性。分子植物育种，2004，2(4)473-480)。谭彩霞等利用水稻品种特青与Lemont杂交组合的F2单株无性系群体，进行2年有重复的抗水稻纹枯病QTLs定位，在特青的第9号染色体和Lemont的第11号染色体上分别定位到了2个主效抗纹枯病QTL位点qSB-9和qSB-11，并以二者紧密连锁的分子标记进行辅助选择，将两个位点在子代中进行累积，获得比两亲本抗性提高两个数量级的材料。(谭彩霞，纪雪梅，杨勇，潘兴元，左示敏，张亚芳，邹军煌，陈宗祥，朱立煌，潘学彪。水稻回交世代中两个抗纹枯病主效数量基因的鉴定与标记辅助选择。遗传学报，2005，132(4)400-406)。
在细胞质雄性不育系的分子标记辅助选择中，盖树鹏等曾试图发展洋葱细胞质雄性不育分子标记辅助选择方法，他利用RAPD扩增寻找不育系线粒体基因组的特异性分子标记带谱、然后将其转换成SCAR标记的方法，但并没有成功。其获取的两条A、B之间的差异条带在转化成SCAR标记后，一条没有特异性扩增，而另一条不能与细胞质雄性不育株发生共分离(盖树鹏，孟祥栋，徐丽娟。大葱雄性不育分子标记辅助选择的研究。分子植物育种，2004，2(2)223-228)。说明该标记缺乏特异性，在实际生产中没有应用价值。
而水稻中，何光华等利用RAPD技术筛选了野败型珍汕97A和珍汕97B叶绿体基因组的差异，在A、B之间找到了一条特异性的稳定扩增条带，并通过测序之后发现该序列位于叶绿体tRNA-Leu gene的上游，其中A较B中多了一段包含AGAAAA六碱基的重复片段单元，据此序列将其转换成SCAR标记后，该片段在5个野败不育系中可以稳定扩增，而保持系中没有。因此，他们认为该片段可以作为筛选野败型不育系的特异性分子标记(He GH，Hou L，Xiao YH，LuoXY，Niu GQ，Yang GW，Pei Y.A common sequence difference between cytoplasmicmale sterile lines and their maintainer lines existing in rice(Oryza sativa L.)chloroplast tRNA-Leu gene region.Euphytica，2003，131269-274)。
此外，日本的Ichii等也利用野败型不育系珍汕97A和保持系珍汕97B进行大规模的RAPD筛选，在二者之间发现一条1.6Kb的差异性扩增带，该片段为不育系所特有，而保持系缺乏。进一步提取不育系、保持系和恢复系的线粒体基因组DNA进行PCR验证，发现该片段为不育系线粒体所特有，而保持系和恢复系线粒体均不含此片段。对杂种F1和F2的验证表明该片段与不育株共分离，说明该标记的确为野败型不育系所特有。但若以该标记引物对DA型不育系线粒体DNA进行扩增，其扩增带为两条，一条为0.7Kb，一条为1Kb，与野败型的不同(Ichii M，Hong DL，Ohara Y，Zhao CM，Taketa S.Characterization of CMS andmaintainer lines in indica rice(Oryza sativa L.)based on RAPD marker analysis.Euphytica，2003，129249-252)。
以上的两种方法均建立在野败型不育系珍汕97A中特异性扩增的DNA片段基础之上，只能跟踪具有与珍汕97A完全相同的细胞质，因而主要适用于野败型杂种的纯度鉴定。由于在植物线粒体基因组中积累了大量的非编码DNA序列，这些特定的DNA序列虽然在某一水稻生态型中具有唯一性，但他们并不编码与细胞质雄性不育相关的功能基因，因而缺乏普遍性，不能广泛地对含野败型不育基因的其他野生稻和农家种的细胞质材料进行有效鉴定。
红莲型和包台型细胞质雄性不育属于配子体型细胞质雄性不育，遗传上有别于传统的野败型。尽管日本的Kadowaki等于1990年克隆了包台型细胞质雄性不育的相关基因orf79(Kadowaki KT，Suzuki T，Azama S.A chimeric gene containingthe 5portion of atp6 is associated with cytoplasmic male-sterility of rice.Mol GenGenet，1990，22410-16)，易平等也于2002年克隆了红莲型细胞质雄性不育相关基因orfH79(Yi Ping，Wang Li，Sun Qingping，ZhuYingguo.Discovery ofmitochondrial chimeric-gene associated with cytoplasmic male sterility of HL-rice，Chinese Science Bulletin，2002，47744-747)；但利用该基因作为分子标记选择红莲型细胞质雄性不育系还没有公开的报道。2003年我们以orfH79为标记进行PCR扩增，发现该基因在红莲型杂交稻及其衍生的子代中均可检测到该分子标记的存在，说明该分子标记对红莲型具有专一性。进一步以该基因在野生稻和水稻农家品种中进行筛选，发现部分野生稻和农家品种中含有该基因，以这些野生稻为母本与红莲型保持系进行杂交并回交培育出稳定的具有圆败特征的新的红莲型细胞质雄性不育类型。说明利用该基因作为分子标记，可对红莲细胞质进行准确鉴定，选育类似于红莲的配子体细胞质雄性不育系。通过这种分子标记鉴定的方法，不仅具有准确，快速等优点，而且有益于丰富不育系的遗传多样性；同时，还将繁重的田间劳动变成简单的实验室操作，大大降低了田间劳动强度，可以大批量、广泛地对野生稻和传统水稻种质资源进行筛选，大幅度提高红莲型配子体细胞质雄性不育系的选育效率。

发明内容
本发明的目的在于提供一种快速定性检测红莲型细胞质的方法，该方法可以使原来盲目的大量的田间杂交工作被简单的实验室操作所取代，对育种材料的选择由盲目变为精确，大幅度减少了人力资源的浪费，提高了工作效率。为了实现上述目的，本发明涉及以下技术措施1、特异的细胞质雄性不育基因扩增的PCR引物设计引物设计基于水稻线粒体基因组内的红莲型细胞质雄性不育相关基因orfH79的全长(Yi P，Wang L，Sun Q，Zhu Y(2002)Discovery of mitochondriachimeric gene associated with male sterility of Honglian-rice.Chinese ScienceBulletin，47744-747.)，序列如下正向引物F5’-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3’反向引物R5’-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3’2、大规模微量DNA的提取DNA的快速、简便提取方法的发展是分子标记在生产上大规模应用的前提条件，为了促进该方法在生产上的开发应用，发展了一套简单高效、低成本的DNA提取方法，其流程是(1)取一段长1-2cm、宽0.5cm的水稻嫩叶及0.2克粉末状石英沙，依次放入一1.5ml离心管中，用一次性微型塑料研杵将叶片研磨成浆，加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min。
(2)在水浴后的离心管中加入500μl氯仿-异戊醇(24∶1)，充分混匀，台式离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管。
(3)加入600μl冷冻的国产无水乙醇，充分混匀，4℃或冰上放置20min，12000rpm离心15min，到掉上清液，将离心管倒置10min使酒精滤干，然后溶于30μl TE。
3、标准PCR扩增体系的建立PCR扩增反应以典型的红莲不育系粤泰A和保持系粤泰B作对照。
标准的PCR扩增反应体系体积为25μl，组成如下总DNA 1μl(50ng)10×PCR buffer(pH8.3) 2.5μl25mM MgCl21μl
25μm dNTP 1μl一单位Taq酶 1μl5pM的引物F 1μl5pM的引物R 1μl去离子无菌水(ddH2O) 16.5μl反应物混合后离心，用矿物油覆盖，PCR扩增在MJ-100型PCR仪上进行，PCR反应程序如下1cycle 94℃ 5min30cycle94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min1cycle 72℃ 5minstore 4℃4、扩增DNA片段检测分析扩增片段在1.5％的琼脂糖胶上电泳，用DNAExtraction kit(Fermentas K0513，Canada)纯化回收。
(1)如果对照粤泰A只有明亮的一条240bp的特异性扩增带，而粤泰B为阴性(无特异性扩增带)，那么说明PCR结果可靠。
(2)被检测材料(水稻或野生稻)的带型同典型的红莲不育系粤泰A相一致时，说明该材料为阳性，含有类红莲型细胞质；如果与粤泰B一样没有扩增带，则说明该材料为阴性，不含类红莲型细胞质。
5、核苷酸序列分析(1)在紫外透照仪上，用无菌刀片挖出琼脂糖凝胶上的目标带放入无菌Eppendorf管，用天平称量琼脂糖凝胶重量，并估算体积(1g≈1ml)，加入3倍体积的Binding Solution。
(2)55℃水浴5-10min，直到琼脂糖凝胶完全熔化。
(3)加入5μl硅胶溶液，若DNA≥2.5μg，则每增1μgDNA多加1μl硅胶液。
(4)55℃水浴5min使DNA与硅胶结合，其间不时轻弹Eppendorf管使硅胶悬浮。
(5)室温(20-25℃)10000rpm离心20sec，去上清液。
(6)Eppendorf管中加入0.5ml Washing buffer液，轻弹使硅胶悬浮。
(7)室温(20-25℃)10000rpm离心20sec，去上清液，用Washing buffer重复洗涤两次，风干沉淀。
(8)用20μl TE或无菌ddH2O完全悬浮沉淀，55℃水浴5min使DNA释放入TE或ddH2O中。
(9)室温(20-25℃)14000rpm离心1min，吸取上清液，即得纯化好的DNA片段，取少量电泳检查回收纯化效果。
(10)将回收片段根据Promega公司提供的标准程序将回收的DNA克隆到pGEM-T载体(Promega A3600，USA)，挑选白色的阳性克隆，由上海联众基因有限公司进行DNA测序。
(11)将测序结果与红莲的orfH79(SEQ ID NO1)以及包台的orf79序列(SEQ IDNO4)在Gene Bank网页上用Align two sequences(bl2seq)工具(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行网上同源比对。核苷酸序列的同源性比较表明，野生稻中扩增的基因序列与orfH79和orf79的同源程度达到98％-100％，说明这些野生稻和农家种含有红莲型配子体细胞质雄性不育基因。其中SEQ ID NO2和SEQ ID NO3是两种新变异类型。
本发明的优点本发明与传统杂交育种方法相比具有以下优点和效果(1)快速、准确、可靠核酸提取加上PCR反应，总共仅需3-4小时。
(2)设备简单，只需要PCR仪、台式离心机等即可，普通的分子生物学实验室皆可完成。
(3)方法简便、操作方便PCR反应不需要特别的技术培训，一般的大学毕业生或经过短暂培训的实验员均可独立操作。
(4)可同时进行高通量的样品检测一次PCR反应可以检测96个材料。
(5)具有可预测性、大幅度提高育种效率传统的杂交方法无法预测杂交的结果，而通过分子检测的材料可以肯定获得所需要的不育系，可以事先对材料进行选择，大幅度提高育种效率。
(6)可以拓宽不育系育种材料的选择范围，增加遗传多样性传统育种方法认为不育系的选育一般只能通过野生稻和栽培稻杂交来获得，而且一般获得的是孢子体类型不育系；而红莲型配子体细胞质目前还没有第二家报道。而该方法不仅在野生稻中，而且在栽培稻中也检测到配子体细胞质，并通过与红莲保持系杂交获得了类似于红莲的圆败型配子体不育系。


图1orfH79在野生稻中的PCR扩增筛选示意图。Marker，DNA分子量标记DL2000；YtA，粤泰A；YtB，粤泰B；含有与粤泰A相一致的240bp的扩增条带，表明该材料携带类红莲型细胞质。
图2以orfH79为标记经PCR扩增筛选的野生稻的进一步验证示意图。Marker，DNA分子量标记DL2000；YtA，粤泰A；YtB，粤泰B；粤泰B为阴性，而筛选的8个野生稻与粤泰A为阳性，含有一条特异性的240bp的扩增条带。
图3以orfH79为探针的Southern blot分析图。M，DNAmarker λDNA/HindIII；粤泰A和野生稻均有一条500bp左右的特异带。
图4杂种及其子代花粉。野生稻w46/粤泰B杂交F1和BC2F1花粉粒育性(在I2-KI溶液中花粉粒染色较浅，并呈圆球形，显示出典型的圆败特征)。
图5利用野生稻w46与粤泰B杂交、回交选育的不育系及其杂种F1花粉。野生稻w46/粤泰B回交的BC6F1花粉粒在I2-KI溶液中花粉粒染色较浅，并呈圆球形，显示出典型的圆败特征；而w46A/95102R有50％的花粉可育。
具体实施例方式
一种利用分子标记快速检测配子体细胞质的方法，其具体步骤如下1、特异的细胞质雄性不育基因扩增的PCR引物设计引物设计基于水稻线粒体基因组内的红莲型细胞质雄性不育相关基因orfH79的全长，序列如下正向引物F5’-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3’反向引物R5’-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3’2、微量DNA的提取(1)以粤泰A、B作对照，选择来自国际水稻所的172个AA基因组野生稻和190个农家种(部分材料见表1)为材料，分别剪取一段长2cm、宽0.5cm约0.1g嫩叶，放入一1.5ml的离心管中并加入0.2克粉末状石英沙，标记离心管，用一次性微型塑料研杵将叶片研磨成浆；然后加入500μl的CTAB提取液，65℃水浴25-30min。
(2)在水浴后的EP管中加入500μl氯仿-异戊醇(24∶1)，充分混匀，台式离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管。
(3)加入600μl冷冻的国产无水乙醇，充分混匀，冰上放置20min，12000rpm离心15min，到掉上清液，将离心管倒置10min使酒精滤干，然后溶于30μl TE溶液，分光光度计测定每个样品的DNA浓度，-20℃保存。
表1 来自国际水稻研究所(IRRI)的野生稻材料鉴定


3、PCR扩增筛选对362个野生稻和农家种提取的DNA分别取5μl稀释至50ng/μl，用于PCR扩增检测。PCR扩增反应以典型的红莲不育系粤泰A和保持系粤泰B作对照，每个材料扩增一管，扩增采用标准的扩增体系反应体积为25μl，组成如下模板DNA 1μl(50ng)10×PCR buffer(pH8.3)2.5μl25mM MgCl21μl25μm dNTP 1μl一单位Taq酶 1μl5pM的引物F 1μ15pM的引物R 1μl去离子无菌水(ddH2O) 16.5μl反应物混合后离心，用矿物油覆盖，在MJ-100型PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应程序如下1cycle 94℃ 5min30cycle94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min1cycle 72℃ 5minstore 4℃4、扩增DNA片段检测分析(1)每管扩增产物在1.5％的琼脂糖胶上电泳，结果表明对照粤泰A只有明亮的一条240bp的特异性扩增带，而粤泰B为阴性(无任何扩增带)，这说明PCR反应结果可靠。
(2)被检测的362个材料中，有31个被扩增出同粤泰A完全相同的带型，其他材料则同粤泰B一样，均为空白(图1)。说明这31个材料含有红莲型细胞质，和粤泰A一样拥有红莲不育基因orfH79。
(3)选择其中的8个与粤泰A、B进行进一步的PCR验证，结果表明该特异带扩增稳定，无其他杂带出现，说明该方法稳定可靠(图2)。
(4)为了进一步确证PCR扩增结果并非来自污染的假阳性，以8个野生稻的嫩叶为材料，提取粗线粒体DNA用HindIII进行酶切消化，以orfH79为探针进行Southern杂交。Southern杂交图谱显示所有8个野生稻同粤泰A一样，都有一条约500bp大小的杂交条带；而对照粤泰B为空白(图3)。这一结果进一步说明这一特异带来自粤泰A和野生稻各自的线粒体基因组，orfH79具有红莲型的特异性和PCR扩增的稳定可靠。
5、核苷酸序列分析(1)对31个筛选出来的含orfH79的材料分别再一次扩增，然后进行电泳，每个加样孔加样20μl，80V电压下电泳1h后，在紫外透照仪上，用无菌刀片挖出琼脂糖凝胶上的目标带约0.2g，放入无菌1.5ml离心管，分别标记离心管，用DNA Extraction kit(Fermentas K0513，Canada)纯化回收。
(2)回收时，用天平准确称量琼脂糖凝胶重量，按照1g约等于1ml体积的办法将重量转换成体积，然后分别加入3倍体积的Binding Solution。
(3)55℃水浴5-10min，直到琼脂糖凝胶完全熔化。
(4)加入5μl硅胶溶液，若DNA≥2.5μg，则每增1μg DNA多加1μl硅胶液。
(5)55℃水浴5min使DNA与硅胶结合，其间不时轻弹Eppendorf管使硅胶悬浮。
(6)室温(20-25℃)10000rpm离心20sec，去上清液。
(7)Eppendorf管中加入0.5ml Washing buffer液，轻弹使硅胶悬浮。
(8)室温(25℃)10000rpm离心20sec，去上清液，沉淀用Washing buffer重复洗涤两次后凉干。
(8)用20μl TE完全悬浮沉淀，55℃水浴5min使DNA释放入TE中。
(9)室温(20-25℃)14000rpm离心1min，吸取上清液，即得纯化好的DNA片段，取少量电泳检查回收纯化效果。
(10)将回收片段根据Promega公司提供的标准程序将回收的DNA克隆到pGEM-T载体(Promega A3600，USA)，分别挑选3个阳性克隆，由上海联众基因有限公司进行DNA测序，得到SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
(11)将测序结果与红莲的orfH79(SEQ ID NO1)以及包台的orf79序列(SEQ IDNO4)在Gene Bank网页上用Align two sequences(bl2seq)工具(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行网上同源比对。核苷酸序列的同源性比较表明，野生稻中扩增的基因序列与orfH79和orf79的同源程度达到98％-100％，说明这些野生稻和农家种含有红莲型配子体细胞质雄性不育基因。其中SEQ ID NO2和SEQ ID NO3是两种新变异类型。
6、杂种子代育性的表型分析(1)为了进一步验证室内分析的结果，随机选择了4个含红莲型细胞质的野生稻作母本与保持系粤泰B进行杂交，观察子代的育性表现。结果表明在杂交组合w15×粤泰B和w20×粤泰B中，其F1子代为可育或部分可育，花粉育性分别为73.8％和8.6％；自然结实率分别为67％和8.3％。而杂交组合w34×粤泰B和w46×粤泰B其子代F1不育(表2)。
(2)用F1与粤泰B回交得BC1F1一代的育性观察发现，2个可育组合的回交群体发生育性分离，其不育株约占一半，并呈典型的圆败特征(表3)。显微观察发现，在4个组合的杂种一代或者回交一代的不育株中，其花粉有染色和不染色(或染色较浅)之分，不染色的花粉在形态上绝大部分是规则的圆形(图5)，少数为不规则形。
(3)选回交子代中的极端不育株连续与粤泰B回交，至BC6F1不育系群体育性已经完全稳定，花粉在1％的KI-I2溶液中不染色，并且95％以上的具有典型的圆败特征。
(4)用新选育的类红莲不育系与恢复系杂交，杂种F1的花粉只有50％可育，但是结实率正常，达80％以上(图6)，说明从野生稻中新选育的不育系具有典型的配子体不育类型特征。
以上的实验结果说明该方法不仅理论上可靠，而且在实际生产中被证明完全可行。
表2 野生稻与粤泰B杂种F1的育性鉴定


表3 以粤泰B作轮回亲本的回交群体BC1F1中完全不育株的育性鉴定

SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>红莲型细胞质雄性不育基因orfH79序列<130>红莲型细胞质雄性不育基因orfH79序列<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>240<212>DNA<213>rice<400>1atgacaaatc tgctccgatg gctcttctcc actacccgag ggactaacgg tcttccatat60ttcatcttcg gtgtcgttgt aggaggcgcc ctgttgtttg ctttgctaaa gtatcaggcc120cctctgtacg acccggcttt attggacaaa atcatagatc ataatataaa agccgggcac180cctatagagg ttgactattc gtggtggggc acctctattc gtgtagtctt tcctaagtaa240<210>2<211>240<212>DNA<213>rice<400>2atgacaaatc tgctccgatg gctcttctcc actacccgag ggactaacgg tcttccatat60ttcatcttcg gtgtcgttgt aggaggcgcc ctgttgtttg ctttgctaaa gtatcaggcc120cctctgtacg acccggcttt aatggctaaa atcatagatc ataatataaa agccgggcac180cctatagagg ttgactattc gtggtggggc acctctattc gtgtagtctt tcctaagtaa240<210>3<211>240<212>DNA<213>rice<400>3atgacaaatc tgctccgatg gctcttctcc actacccgag ggactaacgg tcttccatat60
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权利要求
1.一种快速定性检测红莲型细胞质的方法，它包括下列步骤A、PCR引物设计正向引物F5’-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3’；反向引物R5’-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3’；B、DNA的提取首先取一段长1-2cm、宽0.5cm，重0.1克的水稻嫩叶及0.2克粉末状石英沙，依次放入一1.5ml离心管中，将叶片研磨成浆，加入500μlCTAB提取液，65℃水浴25-30min；其次是在水浴后的离心管中加入500μl氯仿/异戊醇/24∶1，混匀，离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管；第三是加入600μl无水乙醇/-20℃，混匀，4℃冰上放置20min，12000rpm离心15min，倒掉上清液，将离心管倒置10min使酒精滤干，然后溶于30μl无菌水即可。C、PCR扩增体系的建立标准的PCR扩增反应体系为25μl，组成如下总DNA/50ng 1μl10×PCR buffer/pH8.32.5μl25mM MgCl21μl25μm dNTP 1μl一单位Taq酶 1μl5pM的引物F 1μl5pM的引物R 1μl去离子无菌水/ddH2O 16.5μl反应混合物用矿物油覆盖，PCR反应程序如下1cycle94℃5min30cycle94℃1min；55℃1min；72℃1min1cycle72℃5minstore4℃；D、扩增DNA片段检测首先是扩增片段在1.5％的琼脂糖胶上电泳，用DNA Extraction kit纯化回收；其次是阳性细胞质的鉴定(1)对照粤泰A有一条240bp的特异性扩增带，粤泰B为阴性，PCR结果可靠；(2)被检测材料的带型同红莲不育系粤泰A相一致时，该被检测材料为阳性，含有红莲型细胞质；被检测材料没有扩增带，该材料为阴性，不含红莲型细胞质；E、核苷酸序列分析(1)在紫外透照仪上，用无菌刀片挖出琼脂糖凝胶上的目标带放入无菌Eppendorf管，用天平称量琼脂糖凝胶重量为1ml；(2)加入3倍体积的Binding Solution；(3)55℃水浴5-10min，直到琼脂糖凝胶熔化；(4)加入5μl硅胶溶液，DNA≥2.5μg，每增1μg DNA多加1μl硅胶液；(5)55℃水浴5min使DNA与硅胶结合，其间弹Eppendorf管使硅胶悬浮；(6)室温10000rpm离心20sec，去上清液；(7)Eppendorf管中加入0.5ml Washing buffer液，弹硅胶悬浮；(8)室温10000rpm离心20sec，去上清液，用Washing buffer重复洗涤两次，风干沉淀；(9)用20μl TE或无菌ddH2O悬浮沉淀，55℃水浴5min使DNA释放入TE或ddH2O中；(10)室温14000rpm离心1min，吸取上清液，即得纯化的DNA片段，电泳检查回收纯化效果；(11)将回收片段根据Promega程序将回收的DNA克隆到pGEM-T载体上，挑选白色的阳性克隆，由上海联众基因有限公司进行DNA测序；(12)将获得的序列与红莲粤泰A的orfH79序列同源比对，扩增DNA序列与orfH79基因核苷酸的一致性。
全文摘要
本发明公开了一种快速定性检测红莲型细胞质的方法，该方法包括下列步骤，首先是红莲型细胞质雄性不育基因扩增PCR引物设计；其次是DNA的提取；第三是标准PCR扩增体系的建立；第四是扩增DNA片段检测分析；第五是核苷酸序列的分析。本发明方法简便，操作方便，该方法以红莲型细胞质雄性不育特有的分子标记为基础，快速、准确、可靠地通过实验室筛选水稻种质材料，使红莲型细胞质不育系的选育具有强烈的目的性和针对性，克服了传统育种方法的盲目性和低效、工作量巨大的缺陷，提高了新型配子体雄性不育细胞质的选育效率。
文档编号C12Q1/68GK1876837SQ20061001894
公开日2006年12月13日 申请日期2006年4月27日 优先权日2006年4月27日
发明者李绍清, 朱英国, 段世华 申请人:武汉大学