专利名称：一种固定化黄嘌呤氧化酶及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化黄嘌呤氧化酶及其制备方法和用途，适用于黄嘌呤氧化酶的直接电化学研究及制备生物传感器。
背景技术：
黄嘌呤氧化酶是一种分子量较大的氧化还原酶，含有多个电子传递中心，包括一个钼，一个黄素腺嘌呤二核苷酸和两个铁硫族。一直以来，黄嘌呤氧化酶被用于制备检测黄嘌呤或次黄嘌呤的生物传感器，但都需要使用电子媒介体，属于第二代生物传感器。现在人们感兴趣的是第三代生物传感器的研究，也就是酶的直接电化学研究。自从上世纪七十年代以来，人们对黄嘌呤氧化酶的直接电化学进行过研究，但都只取得部分成功，只能得到它的一个或两个电子传递中心的信号，而不能同时得到它的所有电子传递中心的信号。碳纳米管以其独特的结构、电学、力学和光学特性及其在纳米技术领域潜在的广泛应用前景而受到众多电分析工作者的青睐，他们一直致力于将碳纳米管应用到电分析化学中来。但碳纳米管几乎不溶于所有的溶剂，这极大地限制了碳纳米管的实际应用。因此，碳纳米管的溶解或分散技术一直是碳纳米管应用的关键。双十六烷基磷酸是含有两条长碳氢链的疏水性表面活性剂，基于疏水作用碳纳米管可有效地分散于双十六烷基磷酸的悬浮液中，而且双十六烷基磷酸悬浮液有很好的成膜性，容易固定于电极表面。另外，双十六烷基磷酸还可形成类生物膜的双层膜的结构，用来固定酶可保持酶的生物活性。本发明是将碳纳米管和双十六烷基磷酸各自的优良特性结合起来，制备一种混合膜，用电化学方法活化后，直接吸附黄嘌呤氧化酶而实现酶的固定化。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种固定化黄嘌呤氧化酶及其制备方法和用途，该方法制得的固定化黄嘌呤氧化酶不但能同时实现其所有电子传递中心的直接的电子传递，还保持其高度的生物活性，能催化其底物——硝酸根的还原，稳定性和重现性较好，而且该方法本身具有操作简单、条件易于控制等优点。
本发明提供的技术方案是一种固定化黄嘌呤氧化酶，包括40-49.5wt％的碳纳米管、40-49.5wt％的双十六烷基磷酸和1-20wt％的黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤氧化酶吸附在由碳纳米管和双十六烷基磷酸组成的混合膜上。
上述混合膜由下法制得将碳纳米管开管氧化，用水洗涤至中性并烘干，按碳纳米管与双十六烷基磷酸重量比为40∶49.5-49.5∶40的比例，将烘干后的0.5-2毫克碳纳米管和0.5-2毫克双十六烷基磷酸加入到0.5-1毫升的蒸馏水中，超声分散得到碳纳米管和双十六烷基磷酸的分散液；将分散液在基体上，烘干，得到混合膜。
上述基体为玻碳电极。
本发明还提供上述固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，将碳纳米管开管氧化，用水洗涤至中性并烘干，按碳纳米管与双十六烷基磷酸重量比为40∶49.5-49.5∶40的比例，将烘干后的0.5-2毫克碳纳米管和0.5-2毫克双十六烷基磷酸加入到0.5-1毫升的蒸馏水中，超声分散得到碳纳米管和双十六烷基磷酸的分散液；将分散液在基体(如玻碳电极)上，烘干，得到混合膜；将混合膜放入浓度为1-5毫克/毫升的黄嘌呤氧化酶溶液吸附3-8小时，取出后用pH 5.0-8.0的缓冲液(磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液)淋洗，得到固定化黄嘌呤氧化酶；所述黄嘌呤氧化酶溶液是将黄嘌呤氧化酶直接溶于pH 5.0-8.0的缓冲液(磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液)中得到。
在混合膜放入黄嘌呤氧化酶溶液之前，将混合膜在-1.0伏-1.5伏的电位范围内以100-500毫伏/秒的扫速在电化学工作站循环扫描10-30圈。
上述固定化黄嘌呤氧化酶能保持酶的生物活性并可用于硝酸根的检测。
本发明固定化黄嘌呤氧化酶的突出特点是1.能同时实现其所有电子传递中心的直接的电子传递。
2.酶保持其生物活性，能催化其底物——硝酸根的还原。
3.有较好的重现性和稳定性。
4.该发明的操作简单、条件温和、操作参数较易控制，这些有利条件将极大地促进了该固定方法的实际应用，用于生物传感器的制备。
图1为未吸附黄嘌呤氧化酶的单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的玻碳电极和本发明制得的吸附有黄嘌呤氧化酶的单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的玻碳电极在pH 5.0的磷酸缓冲液(充氮气30分钟以除去氧气)的循环伏安图；图2为未吸附黄嘌呤氧化酶的单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的玻碳电极和本发明制得的吸附有黄嘌呤氧化酶的单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的玻碳电极对硝酸根的安培检测图。
具体实施例方式
实施例1固定化黄嘌呤氧化酶及其制备商品化单壁碳纳米管经68％的浓硝酸回流16小时，进行开管氧化(Nature 372(1994)159-162)，用水洗涤至中性并烘干，取1毫克所得的单壁碳纳米管和1毫克的双十六烷基磷酸，加入到1毫升蒸馏水中，超声分散10小时得到稳定的单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸分散液。在抛光好的玻碳电极上滴加2微升所得的分散液，置于红外灯下，待溶剂挥发完全，得到单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸混合膜修饰的玻碳电极。在-1.0伏到1.5伏的电位范围内以500毫伏/秒的扫速在电化学工作站循环扫描20圈，得到活化的修饰电极。将此电极放于2.3毫克/毫升黄嘌呤氧化酶溶液(黄嘌呤氧化酶购自Sigma公司，黄嘌呤氧化酶溶液是将商品的黄嘌呤氧化酶直接溶于pH 5.0的磷酸缓冲液)中直接吸附5小时，拿出后用pH 5.0的磷酸缓冲液充分淋洗，以除去未牢固吸附的黄嘌呤氧化酶。所得的黄嘌呤氧化酶—单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极室温保存待用。
将所得的黄嘌呤氧化酶—单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极放于pH 5.0的磷酸缓冲液(充氮气30分钟以除去氧气)，在-1.0伏到0.1伏电位范围内以150毫伏/秒的扫速进行循环扫描，其结果见图1。图1中曲线a和b分别为未吸附黄嘌呤氧化酶的单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的玻碳电极和吸附有黄嘌呤氧化酶的单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的玻碳电极在pH 5.0的磷酸缓冲液的循环伏安图。图1的内插图是减除了背景的黄嘌呤氧化酶—单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的玻碳电极的循环伏安图。从图1中可以很清楚地看到，在未吸附黄嘌呤氧化酶的修饰电极上没有任何的氧化还原峰出现(曲线a)，而在吸附有黄嘌呤氧化酶的修饰电极上出现三对氧化还原峰(曲线b)。从低电势到高低电势的三对峰分别属于钼、铁硫族和黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化还原峰。说明本发明得到的固定化黄嘌呤氧化酶能同时实现其所有电子传递中心的直接的电子传递。
将所得的黄嘌呤氧化酶—单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极放于pH 5.0的磷酸缓冲液(充氮气30分钟以除去氧气)于-0.36伏下进行硝酸根的安培检测，其结果见图2。从图2中可以很清楚地看到，在未吸附黄嘌呤氧化酶的修饰电极上，加入硝酸钾后，没有任何电流响应(曲线a)，而在吸附有黄嘌呤氧化酶的修饰电极上，连续加入2毫摩尔硝酸钾后，该电极响应迅速增加并能在较快的时间(50秒)达到稳态(曲线b)。说明本发明得到的固定化黄嘌呤氧化酶能催化硝酸根的还原。
实施例2固定化黄嘌呤氧化酶及其制备商品化多壁碳纳米管经68％的浓硝酸回流16小时，进行开管氧化(Nature 372(1994)159-162)，用水洗涤至中性并烘干，取0.5毫克所得的多壁碳纳米管和0.6毫克的双十六烷基磷酸，加入到0.5毫升蒸馏水中，超声分散10小时得到稳定的多壁碳纳米管—双十六烷基磷酸分散液。在抛光好的玻碳电极上滴加2微升所得的分散液，置于红外灯下，待溶剂挥发完全，得到多壁碳纳米管—双十六烷基磷酸混合膜修饰的玻碳电极。在-1.0伏到1.5伏的电位范围内以100毫伏/秒的扫速在电化学工作站循环扫描30圈，得到活化的修饰电极。将此电极放于5毫克/毫升黄嘌呤氧化酶溶液(黄嘌呤氧化酶购自Sigma公司，黄嘌呤氧化酶溶液是将商品的黄嘌呤氧化酶直接溶于pH 8.0的磷酸缓冲液)中直接吸附3小时，拿出后用pH 8.0的磷酸缓冲液充分淋洗，以除去未牢固吸附的黄嘌呤氧化酶。得到黄嘌呤氧化酶—多壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极。
将所得的黄嘌呤氧化酶—多壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极放于pH 8.0的磷酸缓冲液(充氮气30分钟以除去氧气)，在-1.0伏到-0.1伏电位范围内以150毫伏/秒的扫速进行循环扫描，在吸附有黄嘌呤氧化酶的修饰电极上出现三对氧化还原峰。从低电势到高低电势的三对峰分别属于钼、铁硫族和黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化还原峰。说明本发明得到的固定化黄嘌呤氧化酶能同时实现其所有电子传递中心的直接的电子传递。
将所得的黄嘌呤氧化酶—多壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极放于pH 8.0的磷酸缓冲液(充氮气30分钟以除去氧气)于-0.36伏下进行硝酸根的安培检测，在吸附有黄嘌呤氧化酶的修饰电极上，连续加入2毫摩尔硝酸钾后，该电极响应迅速增加并能在较快的时间(50秒)达到稳态。说明本发明得到的固定化黄嘌呤氧化酶能催化硝酸根的还原。
实施例3固定化黄嘌呤氧化酶及其制备商品化单壁碳纳米管经68％的浓硝酸回流16小时，进行开管氧化(Nature 372(1994)159-162)，用水洗涤至中性并烘干，取2毫克所得的单壁碳纳米管和1.7毫克的双十六烷基磷酸，加入到1毫升蒸馏水中，超声分散10小时得到稳定的单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸分散液。在抛光好的玻碳电极上滴加2微升所得的分散液，置于红外灯下，待溶剂挥发完全，得到单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸混合膜修饰的玻碳电极。在-1.0伏到1.5伏的电位范围内以500毫伏/秒的扫速在电化学工作站循环扫描10圈，得到活化的修饰电极。将此电极放于1毫克/毫升黄嘌呤氧化酶溶液(黄嘌呤氧化酶购自Sigma公司，黄嘌呤氧化酶溶液是将商品的黄嘌呤氧化酶直接溶于pH 5.0的Tris-HCl缓冲液)中直接吸附8小时，拿出后用pH 5.0的Tris-HCl缓冲液充分淋洗，以除去未牢固吸附的黄嘌呤氧化酶。得到的黄嘌呤氧化酶—单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极室温保存待用。
将所得的黄嘌呤氧化酶—单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极放于pH 5.0的Tris-HCl缓冲液(充氮气30分钟以除去氧气)，在-1.0伏到-0.1伏电位范围内以150毫伏/秒的扫速进行循环扫描，在吸附有黄嘌呤氧化酶的修饰电极上出现三对氧化还原峰。从低电势到高低电势的三对峰分别属于钼、铁硫族和黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化还原峰。说明本发明得到的固定化黄嘌呤氧化酶能同时实现其所有电子传递中心的直接的电子传递。
将所得的黄嘌呤氧化酶—单壁碳纳米管—双十六烷基磷酸修饰的电极放于pH 5.0的Tris-HCl缓冲液(充氮气30分钟以除去氧气)于-0.36伏下进行硝酸根的安培检测，在吸附有黄嘌呤氧化酶的修饰电极上，连续加入2毫摩尔硝酸钾后，该电极响应迅速增加并能在较快的时间(50秒)达到稳态。说明本发明得到的固定化黄嘌呤氧化酶能催化硝酸根的还原。
权利要求
1.一种固定化黄嘌呤氧化酶，包括40-49.5wt％的碳纳米管、40-49.5wt％的双十六烷基磷酸和1-20wt％的黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤氧化酶吸附在由碳纳米管和双十六烷基磷酸组成的混合膜上。
2.根据权利要求1所述的固定化黄嘌呤氧化酶，其特征是混合膜由下法制得将碳纳米管开管氧化，用水洗涤至中性并烘干，按碳纳米管与双十六烷基磷酸重量比为40∶49.5-49.5∶40的比例，将烘干后的0.5-2毫克碳纳米管和0.5-2毫克双十六烷基磷酸加入到0.5-1毫升蒸馏水中，超声分散得到碳纳米管和双十六烷基磷酸的分散液；将分散液滴涂在基体上，烘干，得到混合膜。
3.根据权利要求1或2所述的固定化黄嘌呤氧化酶，其特征是基体为玻碳电极。
4.权利要求1或2所述固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征是将碳纳米管开管氧化，用水洗涤至中性并烘干，按碳纳米管与双十六烷基磷酸重量比为40∶49.5-49.5∶40的比例，将烘干后的0.5-2毫克碳纳米管和0.5-2毫克双十六烷基磷酸加入到0.5-1毫升的蒸馏水中，超声分散得到碳纳米管和双十六烷基磷酸的分散液；将分散液涂附在基体上，烘干，得到混合膜；将混合膜放入浓度为1-5毫克/毫升的黄嘌呤氧化酶溶液吸附3-8小时，取出后用pH 5.0-8.0的缓冲液淋洗，得到固定化黄嘌呤氧化酶；所述黄嘌呤氧化酶溶液是将黄嘌呤氧化酶直接溶于pH 5.0-8.0的缓冲液中得到。
5.根据权利要求4所述固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征是缓冲液为磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求4或5所述固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征是基体为玻碳电极。
7.根据权利要求4或5所述固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征是在混合膜放入黄嘌呤氧化酶溶液之前，将混合膜在-1.0伏-1.5伏的电位范围内以100-500毫伏/秒的扫速在电化学工作站循环扫描10-30圈。
8.权利要求1或2所述固定化黄嘌呤氧化酶在硝酸根的检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种固定化黄嘌呤氧化酶，包括40－49.5wt％的碳纳米管、40－49.5wt％的双十六烷基磷酸和1－20wt％的黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤氧化酶吸附在由碳纳米管和双十六烷基磷酸组成的混合膜上。其制法为将碳纳米管开管氧化，用水洗涤至中性并烘干，将烘干后的碳纳米管和双十六烷基磷酸加入蒸馏水中，超声分散得分散液；将分散液涂附在基体上，烘干，得到混合膜；将混合膜放入黄嘌呤氧化酶溶液吸附，得到固定化黄嘌呤氧化酶。本发明的突出特点是能同时得到黄嘌呤氧化酶三对氧化还原中心的电化学信号，并且黄嘌呤氧化酶保持其生物活性，能催化其底物—硝酸根的还原，有较好的稳定性和重现性；可用于制备检测硝酸根的生物传感器。
文档编号C12N11/14GK1834241SQ20061001866
公开日2006年9月20日 申请日期2006年3月30日 优先权日2006年3月30日
发明者胡胜水, 吴云华 申请人:武汉大学