专利名称：：一种鉴定白化苗基因型愈伤的方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程领域。本发明涉及一种鉴定白化苗基因型愈伤的方法；更具体的说，本发明涉及一种鉴定由T-DNA插入造成的水稻白化突变体，筛选白化苗纯合基因型愈伤，用于功能互补实验的方法。
背景技术：
：水稻是最重要的粮食作物之一，全世界二分之一以上的人口以其为主食。水稻也是单子叶植物的模式植物，开展其基因功能研究具有重要的经济价值和科研价值。近年来，随着国际水稻基因组测序计划的完成，对水稻基因进行研究分析并最终阐明其功能成为当前紧迫的任务。在克隆基因过程中，当得到一系列的侯选基因后，一般要进行下列分析来确定目标基因(1)检测cDNA是否与目标基因共分离；(2)检测cDNA时空表达特点与表型是否一致；(3)测定cDNA序列，进行生物信息学分析，以了解该基因的功能；(4)筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；(5)进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。目前利用新兴的RNA干扰(RNAi)也可有效地确定目的基因，但是功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。随着大量的基因的分离，基因的功能亟需得到验证，为实现这一目的必然要依托于高效的水稻遗传转化体系，因此水稻遗传转化研究越来越为人们所关注。水稻遗传转化体系已比较完善，农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、花粉管通道法等方法均在水稻遗传转化中应用并获得转基因植株，但目前用的最多的方法是基因枪法和农杆菌介导法。理论上水稻几乎所有具有潜在分裂分化能力的组织和细胞都可以作为受体材料，但要想获得理想的转化结果，根据水稻品种的不同，选择适当的转化受体材料是十分关键的。目前最常用遗传转化受体材料包括成熟胚、幼胚、花药和幼穗。王秀红等通过对水稻不同外植体的培养效果进行分析，四中外植体的培养存在基因型差异，不同外植体的培养效果差异明显。花药愈伤组织诱导率明显偏低，幼胚出愈伤比较容易但存在明显的基因型差异，幼穗和成熟胚的培养易于操作，成熟胚的培养污染明显减少。而且成熟胚的取材不受生长季节的限制，因而成为当前广泛采用的受体材料(水稻不同外植体培养效果及其相关性分析。中国水稻科学，2005，19(2)187-189)。由于T-DNA的插入破坏了基因的功能，造成纯合隐性基因失活，产生一些如白化苗、致死、早衰、不育等无法收获种子的突变体，给互补实验利用成熟胚幼导愈伤带来了一些困难。为了研究这些基因是否具有该功能，必须用这些突变体来诱导愈伤，作为遗传转化的受体材料。因此要获得具有纯合突变基因型的愈伤，才能进行功能互补实验。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种鉴别白化苗基因型愈伤的方法。由于白化苗突变体生长一个月左右后就逐渐死亡，不能获得纯合突变基因型种子，无法进行功能互补实验。利用本方法可以从T-DNA插入造成的白化突变体杂合体后代种子诱导的愈伤中，鉴定出白化苗纯合基因型愈伤，进行遗传转化实验。本发明还包括应用该方法，筛选鉴定由T-DNA插入造成的纯合隐性基因失活而导致的致死、不育、早衰等无法收到种子的突变体的纯合基因型的愈伤筛选。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施，其步骤为1、用杂合基因型水稻植株收获的种子诱导愈伤，通过筛选T-DNA的插入的突变体库，得到由于T-DNA的插入造成基因失活而在T1代产生白化苗突变体家系，如图1所示。利用Tail-PCR(热不平衡交错PCR)技术分离T-DNA插入位点的水稻DNA序列，把基因组序列与水稻基因组数据库进行比较，得到插入T-DNA前后的水稻DNA序列信息。如果出现的白化苗是由于T-DNA插入造成，在T1代植株中在该T-DNA插入位点将出现三种基因型两条姐妹染色体全有T-DNA插入的为白化苗纯合基因；仅有一条染色体上有T-DNA插入的为杂合基因；该位点染色体上无T-DNA插入的为阴性纯合基因，根据分离的水稻基因组序列，在T-DNA两端的水稻基因组上各设计一条引物a5’-GCAAAACAGACTGCGGTGAG-3’，b5’-GAGCCGAGTTAAGACAACGATC-3’，引物c5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’为载体左末端用于分离基因组序列时测序用的引物，如图2所示。抽提苗期DNA进行PCR扩增，白化苗纯合基因型中a+b不能够扩增，a+c可以扩增；杂合基因型中a+b、a+c均能够扩增；该位点无T-DNA插入的阴性纯合基因型中a+b能够扩增，a+c不能够扩增。种植该家系绿苗20株，检测出杂合基因型植株，如图3所示，收获种子，剥去谷壳，75％的乙醇浸泡1分钟，0.15％的升汞浸泡15分钟，用灭菌水清洗5-6次后置于诱导培养基上，放置在27℃光照培养室50天左右，诱导愈伤。2、抽提愈伤DNA。把诱导的愈伤剥离下来，放在继代培养基上，挑取一粒诱导出的愈伤，利用CTAB法抽提愈伤总DNA，加入400μl水溶解DNA。3、利用a，b，c引物PCR扩增愈伤DNA，由于白化苗纯合基因型中a+b不能够扩增，a+c可以扩增，1％的TBE胶电泳PCR产物，检测愈伤基因型。4、挑选出经PCR检测的白化苗纯合基因型愈伤，置于分化培养基上，放置在28℃光照培养室40天，进行分化验证，得到白化苗再生植株。本发明的方法简单易行，鉴别快速方便，结果可靠。本实验中，共诱导杂合种子200粒，诱导出愈伤144粒，经过PCR筛选，得到白化苗纯合基因型愈伤39粒，挑21粒白化苗基因型愈伤放置在分化培养基上分化，18个愈伤分化出苗且全部为白化苗，而作为对照的杂合基因型和野生纯合基因型愈伤分化出的苗子全部为绿苗。鉴定的白化苗基因型愈伤与7愈伤分化的表型完全一致，说明该方法结果准确可靠。用该方法还可鉴定由T-DNA插入造成的纯合隐性基因失活而导致的致死、不育、早衰等无法收到种子的突变体的纯合基因型的愈伤，用于功能互补实验。图1是T0代种子大田播种后两个星期后田间筛选的照片，EV57家系出现白化突变性状，白化苗约一个月左右逐渐死亡；图2是设计共分离引物及引物位置的示意图，灰线条代表T-DNA结构，黑线条代表水稻基因组。a和b分别是T-DNA插入位点两端的基因组序列设计的引物，c是位于T-DNA载体左末端用于侧翼序列测序的引物。a+b和a+c配对均能扩增出0.8kb的条带；图3是用共分离检测引物检测白化苗(a，b)和田间种植绿苗(c，d)的胶图。4a是用引物a+b扩增20个白化苗和一个中花11未转基因的植株作为对照，白化苗均未扩增出条带，对照扩增出条带；4b是用引物a+c扩增20个白化苗和一个中花11未转基因的植株作为对照，白化苗均扩增出条带，对照未扩增出条带；4c是是用引物a+b扩增20个绿苗和一个中花11未转基因的植株作为对照，全部扩增出条带；4d是用引物a+c扩增20个绿苗和一个中花11未转基因的植株作为对照，1、7、18和对照未扩增出条带，其余扩增出条带，表明它们为无T-DNA插入的野生型单株，扩增出电泳带的为T-DNA插入位点杂和的单株；图4是引物a+b扩增T1杂合基因型植株种子诱导的愈伤抽提的DNA图5是引物a+c扩增T1杂合基因型植株种子诱导的愈伤抽提的DNA图4和图5表明10，13，16，18，19，22为白化苗纯合基因型愈伤；7，21，24为阴性植株，其余为杂合基因型植株。图6是白化苗纯合基因型愈伤分化的图片。左边为白化苗纯合基因型愈伤分化，长出白苗，右边为杂合基因型愈伤的分化，长出绿苗；具体实施方式下面以白化苗突变家系为例，介绍一下具体实施方式实施例1检测白化苗的产生是由于T-DNA插入造成将利用增强子捕获系统的T-DNA载体pFX-E24.2-R15(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35418-27.)插入的中花11号粳稻品种(OryzasativaL.subsp.japonicacv.Zhonghua11)的T0代种子25℃浸种4天，37℃催芽3天后，大田播种，两个星期后田间调查得到白化苗突变表型株系EV57。该突变体在幼苗时表现白化性状，如图1所示，生长一个月左右突变体植株逐渐死亡。大田种植20株绿苗用于收获种子做下一步研究。利用CTAB法(Liu等，Agenome-wideanalysisofwidecompatibilityinriceandpreciselocationofs5locusinthemolecularmap.TAG，1997，95809-814)抽提白化苗突变体EV57的总DNA，参照Liu等(ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681；EfficientisolationandmappingofArabidopsisthalianaT-DNAinsertjunctionsbythermalasymmetricinterlacedPCR.PlantJ.，8457-463)报道的Tail-PCR(热不平衡交错PCR)技术分离T-DNA插入位点的水稻DNA序列。为了检测白化突变表型是否与T-DNA插入的基因共分离，在T-DNA插入的两端分别设计引物，如图3所示，引物序列为a5’-GCAAAACAGACTGCGGTGAG-3’，b5’-GAGCCGAGTTAAGACAACGATC-3’，引物c5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’为载体左末端用于测序的引物。由于破坏的为隐性基因，因此，在PCR扩增当中，白化苗突变体a+b引物不能扩增出条带，a+c引物能够扩增出条带；野生型绿苗的a+b能构扩增出条带。PCR反应条件先94℃3分钟变性，然后进入PCR循环，94℃变性30秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。扩增结果如图3所示，可以看出，突变表型与白化苗基因共分离。实施例2、筛选杂合单株收获种子根据T-DNA侧翼基因组序列设计PCR引物，针对本实例，a表示在T-DNA插入位点上游设计的引物，b表示在插入位点T-DNA下游设计的引物，c表示根据T-DNA末端序列设计的引物。在T1代植株中，若为T-DNA插入位点纯合单株，由于T-DNA片段为10kb以上，一般PCR反应不能扩增10kb以上的片段，因此a与b配对的PCR扩增为阴性，但a和c配对可以扩增得到一个0.8kb的产物。若扩增位点为没有T-DNA的插入的野生型单株，由于没有c引物结合的位点，则只有a和b配对是可以得到一个1.0kb的产物。而对于T-DNA插入位点杂合单株，则在a和c配对以及a和b配对时都可以扩增得到产物。根据两对PCR引物的扩增结果，就可以确定T-DNA插入位点杂合单株上收获的种子的基因型，将T-DNA插入位点纯合基因型的愈伤组织鉴定出来作为基因功能互补验证转化的受体。按此方法就可以确定EV57家系T1代杂合植株种子的基因型。收获T1杂合单株种子。实施例3、诱导愈伤，抽提愈伤DNA，鉴定愈伤基因型选取杂合基因型的植株收获的种子，剥去谷壳，用75％乙醇浸泡1分钟，0.15％的升汞浸泡15分钟，然后用灭菌水清洗5-6次，把米粒放在诱导培养基上诱导愈伤(见下面农杆菌介导的遗传转化主要步骤中愈伤组织的诱导部分)。27℃在暗室放置50天左右，即会有愈伤长出，每粒米上诱导出的愈伤挑取一颗用CTAB法(Liu等，Agenome-wideanalysisofwidecompatibilityinriceandpreciselocationofs5locusinthemolecularmap.TheorApplGenet，1997，95809-814)抽提DNA。用a+b，a+c两对PCR引物按照实例1的原理筛选出T-DNA插入纯合基因型，即表型为白化苗的愈伤组织作为基因功能互补验证转化的受体。如图4和图5所示。实施例4、把筛选出来的白化苗基因型愈伤组织置于分化培养基上，直接进行分化，放置于28℃的光照培养室中约50天左右，就会分化出苗。挑出21个白化苗基因型愈伤进行分化，得到18株苗且全部为白化突变表型，而作为对照的杂合基因型和野生纯合基因型愈伤分化出的苗子全部为绿苗，如图6所示。以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应当认为是本发明的保护范围。农杆菌介导的遗传转化步骤和试剂如下(1)试剂和溶液缩写6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)(2)溶液配方1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]硝酸钾(KNO3)28.3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4.0g硫酸铵((NH4)2SO4)4.63g硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.85g氯化钙(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然后20-25℃下定容至1000ml。2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]碘化钾(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.15g20-25℃下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA贮存液(100X)在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4·7H2O)2.78g在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。4)维生素贮存液(100X)烟酸(Nicotinicacid)0.1g维生素B1(ThiamineHCl)0.1g维生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存备用。5)MSmax母液(10X)硝酸铵(NH4NO3)16.5g硝酸钾19.0g磷酸二氢钾1.7g硫酸镁3.7g氯化钙4.4g20-25℃下溶解并定容至1000ml。6)MSmin母液(100X)碘化钾0.083g硼酸0.62g硫酸锰0.86g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.0025g20-25℃下溶解并定容至1000ml。7)2，4-D贮存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，20-25℃保存。8)6-BA贮存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，20-25℃保存。9)NAA贮存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。10)IAA贮存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。12)1N氢氧化钾贮存液氢氧化钾5.6g蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。(3)培养基配方1)诱导培养基N6max母液(10X)100mlN6min母液(100X)10mlFe2+EDTA贮存液(100X)10ml维生素贮存液(100X)10ml2，4-D贮存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基N6max母液(10X)100mlN6min母液(100X)10mlFe2+EDTA贮存液(100X)10ml维生素贮存液(100X)10ml2，4-D贮存液2ml脯氨酸(Proline)0.5gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)分化培养基MSmax母液(10X)100mlMSmin母液(100X)10mlFe2+EDTA贮存液(100X)10ml维生素贮存液(100X)10ml6-BA贮存液2mlKT贮存液2mlNAA贮存液0.2mlIAA贮存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。权利要求1.一种鉴定白化苗基因型愈伤的方法，它包括下列步骤A、用杂合基因型水稻植株收获的种子诱导愈伤，通过筛选T-DNA的插入的突变体库，得到T-DNA的插入造成基因失活而在T1代产生白化苗突变体家系，利用Tail-PCR分离T-DNA插入位点的水稻DNA序列，在T1代植株中在该T-DNA插入位点将出现三种基因型两条姐妹染色体全有T-DNA插入的为白化苗纯合基因型、一条染色体上有T-DNA插入的为杂合基因型和该位点染色体上无T-DNA插入的为阴性纯合基因型，在插入位点T-DNA两端的水稻基因组上各设计一条引物a5’-GCAAAACAGACTGCGGTGAG-3’，b5’-GAGCCGAGTTAAGACAACGATC-3’，引物c5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’为载体左末端用于测序的引物，抽提苗期DNA进行PCR扩增，白化苗纯合基因型中a+b不扩增，a+c扩增；杂合基因型中a+b、a+c能扩增，该位点无T-DNA插入的阴性纯合基因型中a+b能扩增，a+c不能扩增，种植家系绿苗，检测出杂合基因型植株，收获种子，剥去谷壳，75％的乙醇浸泡1分钟，0.15％的升汞浸泡15分钟，用灭菌水清洗5-6次后置于诱导培养基上，放置在27℃光照培养室50天，诱导愈伤；B、抽提愈伤DNA，把诱导的愈伤剥离下来，放在继代培养基上，挑取一粒诱导出的愈伤，利用CTAB法抽提愈伤总DNA，加入400μl水溶解DNA；C、利用a，b，c引物PCR扩增愈伤DNA，白化苗纯合基因型中a+b不能扩增，a+c扩增，1％的TBE胶电泳PCR产物，检测愈伤基因型；D、挑选出经PCR检测的白化苗纯合基因型愈伤，置于分化培养基上，放置在28℃光照培养室40天，进行分化验证，得到白化苗再生植株。全文摘要本发明公开了一种鉴定白化苗基因型愈伤的方法。首先是用杂合基因型种子诱导愈伤，剥去谷壳，乙醇和汞浸泡一定时间，用灭菌水清洗后置于诱导培养基上，放置在光照培养室诱导愈伤；其次是抽提愈伤DNA，把诱导的愈伤剥离下来，放在继代培养基上，挑取一粒诱导出的愈伤，利用CTAB法抽提愈伤总DNA，加入水溶解；第三是通过PCR扩增愈伤总DNA，白化苗基因型中a+b不扩增，a+c扩增，用TBE胶电泳PCR产物检测愈伤基因型；第四是挑选出经PCR检测的白化苗纯合基因型愈伤，置于分化培养基上，放置在光照培养室，进行分化验证。用该方法可鉴定由T－DNA插入造成的纯合隐性基因失活而导致的致死、不育、早衰等无法收到种子的突变体的纯合基因型的愈伤，用于功能互补实验。文档编号C12Q1/68GK101037705SQ200610018548公开日2007年9月19日申请日期2006年3月15日优先权日2006年3月15日发明者吴昌银,郭冬,张启发申请人:华中农业大学