一种动物可食性组织中磺胺类药物残留筛选方法及其试剂盒的制作方法

专利名称：一种动物可食性组织中磺胺类药物残留筛选方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于农产品抗菌素残留检测技术领域，具体地说属于一种利用微生物学方法，筛选动物可食性组织中磺胺类药物残留的方法和用这种方法制备的试剂盒。
背景技术：
磺胺类药物是一类应用最早的人工合成抗菌药物，具有抗菌谱广、疗效强等优点广泛应用于畜、禽、水产养殖中，然而磺胺类药物的过量使用必会导致食用动物产品中的残留。
目前测定食品中磺胺类药物残留的分析方法有理化分析方法和生物分析方法。理化分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光胺衍生化薄层色谱法(TLC)、酶联免疫方法(ELISA)等。这些方法所需仪器价格昂贵，对操作人员要求较高，难于推广，不适合高通量的样品筛选。生物分析方法有ELISA方法和微生物学方法，ELISA方法虽具有快速、灵敏度高等优点，但目前研制的磺胺多残留ELISA试剂盒技术不够成熟，且存在检测费用较高等问题。
应用微生物学方法检测动物食品中磺胺类药物的残留已有报道。它是基于抗菌物质对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，来定性或定量的确定样品中的抗菌药物的残留，具有高通量、快速、方便、敏感等特点，在世界范围内广泛使用。欧盟四平皿法、德国三平皿法、新荷兰肾检测法等方法是将工作菌液加入40～45℃液体状的琼脂培养基中混合均匀，制成平板，4℃下保存，有效期为5d。这种方法操作繁琐，费力，有效期短，且对磺胺类敏感性不好(Korsrud GO，Boison JO，Nouws JF，MacNeil JD.Bacterial inhibition tests used to screen forantimicrobial veterinary drug residues in slaughtered animals.J AOAC Int.1998，81(1)21-4)，由此限制了这些方法在磺胺类残留检测中的应用。美国、加拿大拭子法主要有美国的犊牛抗生素和磺胺类药物筛选试剂盒(Calf Antibiotic and Sulfonamide Test，简称CAST)(U.S.Department of Agriculture(1984)，Performing the Calf Antibiotic and Sulfa Test. A SelfInstructional Guide，USDA/FSIS，Washington，DC；)和抗菌药物快速筛选试剂盒(FastAntimicrobial Screening Test，简称FAST)(Fast Antimicrobial Screen Test，(FAST)for detectionof antibiotic and sulfonamide residues in Livestock kidney tissue-(1994)Performing the CalfAntibiotic and Sulfa Test.A SelfInstructional Guide，USDA/FSIS)，这两种方法均以巨大芽孢杆菌作为工作菌液，两个试剂盒的培养基的组成成分分别为CAST试剂盒的培养基为Mueller-Hinton培养基(如下述的文献所述)，FAST试剂盒的培养基是在上述Mueller-Hinton培养基中加入了葡萄糖和溴甲酚紫。FAST试剂盒对抗生素与磺胺类药物的灵敏度要高于CAST试剂盒，FAST对磺胺类药物的检测限为0.125～0.5μg/g，CAST为0.25～2.0μg/g(参见DeyBP，Thaker NH，Bright SA，Thaler AM.Fast antimicrobial screen test(FAST)improved screen testfor detecting antimicrobial residues in meat tissue.J AOAC Int.，2005，88(2)447-454)，上述两种试剂盒均不能满足磺胺类药物的最大残留限量(0.1μg/g)；同时，FAST对抗生素与磺胺类药物的检测时间要短于CAST，两者检测时间分别为6h和18h。培养基的配方是造成上述两种试剂盒差异的主要原因。克服现有方法和试剂盒存在的检测时间长、灵敏度低和存放期短试剂盒是急待解决的问题。

发明内容
本发明的第一个目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种基于微生物学的、方便、灵敏、用于可食性动物组织中磺胺类药物残留的筛选方法，以克服现有技术灵敏度低、检测时间长、操作费时、费力等缺陷。
本发明的第二个目的是研制与上述目的配套使用的试剂盒，以解决现有试剂盒存放期短，灵敏度较低的问题。
本发明通过以下技术方案实现一种动物可食性组织中磺胺类药物残留筛选方法，包括制备培养基、巨大芽孢杆菌工作菌液、抗菌药物纸片和无菌棉拭子，其制备步骤如下所示1)将培养基、工作菌液、抗菌药物纸片和含有甲氧苄啶的补充液单独制备；2)将巨大芽孢杆菌制成孢子数为1×106个/ml工作菌液；3)将抗菌药物纸片制备成直径为7mm，含新霉素5μg的纸片；4)将所述的培养基制成如下所述的培养基，其组分如下培养基I牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氢钾 0.5～1.0g/L琼脂 15～20g/L无菌小牛血清 30～50ml/L甲氧苄啶 0.016～0.04mg/L补充水分至1L；培养基II牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L
磷酸二氢钾0.5～1.0/L琼脂 15～20g/L无菌小牛血清 30～50ml/L甲氧苄啶 0.016～0.04mg/L对氨基苯甲酸 0.1～0.2g/L补充水分至1L；按照以下步骤制备a)将上述培养基中的牛肉浸膏、酪蛋白胨、可溶性淀粉、磷酸二氢钾和琼脂加热融化，调pH至7.0～7.5，121℃灭菌20min，冷却至50℃；b)向步骤a)中加入灭活的无菌小牛血清和甲氧苄啶，得到培养基I；c)向步骤b)加入对氨基苯甲酸，得到培养基II；d)将步骤b)或c)的培养基分装至培养皿中，使培养基冷却，并使培养皿中培养基的厚度为1.5～2mm；6)将工作菌液均匀涂布于培养基I或II上；7)将新霉素纸片置于培养基上作阳性对照；8)用棉拭子取待测组织的样品，将其置于培养基I或II上；9)向棉拭子上滴加补充液；和10)将培养基I或II置于温度44～45℃，培养5～8h，根据培养基I和II上抑菌圈的出现情况判断待测样品中是否含有磺胺类药物。
在本发明中，所述的补充液中甲氧苄啶为1.5～2μg/ml(用10％NaCl溶液配制)。
基于上述发明，本发明制备一种适用于动物可食性组织中磺胺类药物残留筛选的试剂盒，该试剂盒包括工作菌液、培养基、抗菌药物纸片和无菌棉拭子。所述的工作菌液为孢子数为1×106个/ml的巨大芽孢杆菌菌液，所述的抗菌药物纸片为5μg新霉素/∮7mm，所述的补充液为甲氧苄啶液，所述的培养基为培养基I和培养基II联用的培养基，按照以下组分配制培养基I牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氢钾 0.5～1.0g/L琼脂 15～20g/L无菌小牛血清 30～50ml/L甲氧苄啶 0.016～0.04mg/L补充水分至1L；培养基II
牛肉浸膏1.5～3g/L酪蛋白胨8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氢钾 0.5～1.0/L琼脂15～20g/L无菌小牛血清30～50ml/L甲氧苄啶0.016～0.04mg/L对氨基苯甲酸0.1～0.2g/L补充水分至1L；按照以下步骤制备a)将上述培养基中的牛肉浸膏、酪蛋白胨、可溶性淀粉、磷酸二氢钾和琼脂加热融化，调pH至7.0～7.5，121℃灭菌20min，冷却至50℃；b)向步骤a)中加入灭活的无菌小牛血清和甲氧苄啶，得到培养基I；c)向步骤b)的培养基中加入对氨基苯甲酸，得到培养基II；d)将步骤b)或c)的培养基分装至培养皿中，使培养基冷却，并使培养皿中培养基厚度为1.5～2mm。
在本发明中，所述的含有甲氧苄啶的补充液溶液是用10％NaCl溶液配制而成，其中含甲氧苄啶1.5～2μg/ml(该补充液是在检测过程中专门用于棉拭子取待测组织的样品时作为增效剂的使用，它是一个独立的成分(核心试剂)，而培养基中加入的甲氧苄啶是在配制培养基中预先与其他上述组分一起加入的)。
本发明的试剂盒可应用于在体外检测动物可食性组织中磺胺类药物残留。
本发明试剂盒的检测原理是利用甲氧苄啶(TMP)与磺胺类药物的协同作用增强细菌对磺胺类药物的敏感度，通过补充培养基和待测棉拭子中TMP的含量以提高样品中磺胺类药物的检出能力。利用对氨基苯甲酸(PABA)与磺胺类药物之间的拮抗作用，通过在培养基中补充PABA含量消除磺胺类药物的影响，通过有和没有PABA两种培养基联合定性分析残留物是否为磺胺类药物。
本发明的优点及效果本发明采用了菌种和培养基分离的方法，主要试剂均以工作液形式提供，解决了传统微生物方法稳定性差的问题；在测定样品时，只需将棉拭子插入组织样品，样品前处理简单，整个测定过程由6h缩短为5h，适合高通量的样品筛选；对磺胺类药物的灵敏度低，适用于定性检测动物组织样品中多种磺胺类药物残留；操作方法方便易行、灵敏度高、简单、快速，将会为磺胺类药物残留的监控提供有力的保障。


图1、图2是应用本发明的试剂盒对样品中磺胺类药物残留的结果判定示意图，新霉素纸片在图1和图2的培养基上所产生的抑菌圈直径20～26mm，A在图1A和图2A上，棉拭子周围均无抑菌圈，结果判定为阴性；B棉拭子在图1B上有清晰抑菌圈，在图1B上无抑菌圈，抑菌圈直径≥6mm者，结果判定为阳性，表明有磺胺类药物残留；C棉拭子在图1C和图2C均有清晰抑菌圈，则表明存在除磺胺类药物以外的其他药物残留。
图3是本发明试剂盒与同类试剂盒CAST、FAST试剂盒对磺胺类药物标准溶液的最低检测限的比较柱形图。图中SST代表为本发明试剂盒，CAST代表CAST试剂盒，图例FAST代表FAST试剂盒；SD为磺胺嘧啶，SM2为磺胺二甲嘧啶，SQ为磺胺喹噁啉，SMP为磺胺甲氧哒嗪，SMM为磺胺间甲氧嘧啶，SMZ为磺胺甲基异噁唑。
图4是储存时间对新霉素纸片抑菌圈直径大小的影响。
图5是储存时间对巨大芽孢杆菌应用工作菌液菌落浓度的影响。
图6是本发明的筛选方法及其试剂盒——涂拭接种示意图，图中A、标记点(X)开始，上下来回，由右向左涂拭；B、将培养皿顺时针转动1/4圈，重复1涂拭；C、再将培养皿转动1/4圈，重复1涂拭过程；D、再将培养皿转动1/4圈，重复1涂拭过程；E、最后将培养皿顺时针转动1/2圈，重复A的涂拭过程。
图7是拭子与新霉素纸片的放置示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规方法操作，参见Dey B.P.，White C.A.and Thakre N.H..Detection of antimicrobial residues by fastantimicrobial screen test(FAST).USDA/FSIS.Microbiology Laboratory Guidebook.3rd edition，1998。鉴于本发明的方法和试剂盒研制互为依存，为了节约篇幅，以下的描述是将检测方法的建立与试剂盒合在一起描述。
实施例1、筛选方法的建立(1)最佳培养基的设计在基础培养基的成分(牛肉浸膏1.5g/L，酪蛋白胨8.5g/L，可溶性淀粉0.75g/L)上测定三种影响药物敏感性的因素试验，分别为ATMP的浓度TMP4μg/ml、TMP1.6μg/ml、TMP0.2μg/ml，按培养基体积1％添加；B培养基加至培养皿的体积5.5ml、7ml和8.5ml；C血清占培养基总量，依次设计为3％、5％、7％，以磺胺嘧啶0.1μg/ml为对象，涂拭孢子数为1×106个/ml的巨大芽孢杆菌工作菌液(Bacillus megaterium，菌株编号为ATCC9885，参见U.S.Department of Agriculture(1984)Performing the Calf Antibiotic and Sulfa Test.A SelfInstructional Guide，USDA/FSIS，Washington，DC，购自美国菌种保藏机构，罗克维尔，马里兰州(American Type Culture Collection，Rockville，MD))(下列实施例均为同一来源菌株)，确定最佳培养基。结果表明按重量/体积计，牛肉浸膏1.5g/L，酪蛋白胨8.5g/L，可溶性淀粉0.75g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，琼脂粉15g/L，加蒸馏水定容至1L，调pH为7.0。121℃灭<p>表8.实施例3引物特性

扩增产物长142碱基，解链温度82.3℃。限制性内切酶圖譜分析表明擴增產物内有二個MwoI切點(105和114)。PCR反应首次变性81-94℃一分鐘，循環變性81-94℃10秒鐘，退火60℃一分鐘，延伸70℃30秒鐘。對照組不加酶，試驗組每100微升反應液加酶2微升。
试验结果列于表9。
表9.实施例3试验结果

結果說明變性溫度太低擴增產物不能完成變性，對照組和試驗組均無擴增產物形成。變性溫度太高限制性核酸内切酶MowI失活，對照組和試驗組均形成擴增產物，控制適當的變性溫度對照組形成苦增產物而試驗組沒有擴增產物形成。
“-”表示未出现抑菌圈(3)对氨基苯甲酸浓度的确定取供1μg/ml磺胺嘧啶1ml，至一个平皿中，将1×106个/孢子的巨大芽孢杆菌稀释成10-4，再向平皿中加入稀释好的巨大芽孢杆菌菌液1ml，注入15ml含不同浓度(0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L和1g/L)PABA的检测用琼脂培养基，同时设不加PABA空白对照组。每浓度5个平皿，共重复3次。重复培养后同一取样的5个平皿结果相加。测定结果如表3所示。
结果表明培养基中PABA浓度为0.2g/L为最佳浓度。
表3不同浓度对氨基苯甲酸对磺胺嘧啶作用的巨大芽孢杆菌细菌数的影响

实施例2、试剂盒的制备(1)试剂盒的组成本发明的试剂盒包括装有培养基的培养皿、孢子数为1×106个/ml的巨大芽孢杆菌菌液、5μg/直径7mm新霉素滤纸片、2μg/ml甲氧苄啶补充溶液和无菌棉拭子(规格棉拭子头部长度26～30mm，直径4.2～4.8mm。121℃灭菌15min，37℃干燥，密封保存)。
(2)菌种的制备取巨大芽孢杆菌菌种接种于3个脑心浸出液培养基琼脂上(购自英国Oxoid公司)，37℃培养18h。挑单个菌落接种至血琼脂培养基，37℃培养18h。每个培养基上先挑取3个典型菌落作生化鉴定，然后挑取鉴定合格的单个菌落接种至AK-2芽孢生长琼脂试管斜面(Dey BP，White C A and Thakre N H.Detection of antimicrobial residues by fast antimicrobial screen test(FAST).USDA/FSIS.Microbiology Laboratory Guidebook.3rd edition，1998)(菌种在培养和纯化时，必须经生化鉴定合格后，才能进行下一步操作，否则菌种重新培养)，37℃培养18h。用无菌生理盐水洗下芽孢，移至有AK-2芽孢生长琼脂的鲁氏瓶中，37℃培养18～24h后，室温培养6d，镜检。当有80％芽孢形成时，用灭菌生理盐水冲洗芽孢至灭菌的三角烧瓶中，100℃水浴加热10min，分装，在10000r/min离心20min，弃上清液。沉淀物用灭菌生理盐水悬浮，离心，重复洗涤2次，将沉淀物用灭菌生理盐水重新悬浮成孢子混合液。
称取聚乙二醇4000 11.8g于100ml带刻度的带塞玻璃瓶中，于121℃灭菌5min；加入灭菌磷酸盐缓冲液(3mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.1)磷酸氢二钾306.9g和磷酸二氢钾168.6g溶解至去离子水1000ml)34.1ml，充分震荡，5000r/min漩涡混合5min，弃去。加入11.8g灭菌聚乙二醇4000，磷酸盐缓冲液溶液(配方同前，pH7.1)34.1ml，前述孢子混合液25ml，用灭菌水补充至100ml，在5000r/min漩涡混匀5min，分装到离心管中，于3000r/min离心2min。取上层液体至另一无菌50ml离心管中，于5℃，10000r/min下离心20min，弃去上清液。沉淀物加灭菌水20ml悬浮，在10000r/min条件下，5℃，离心20min，弃取上清液，重复洗涤5次。沉淀物用50％乙醇悬浮，收集菌悬液于100ml无菌玻璃瓶中，密封，4℃保存，有效期6个月。
菌落计数将巨大芽孢杆菌悬液用Butterfield磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾0.0425g溶解至1000ml去离子水，pH7.2)稀释成10-1～10-10的菌液。取稀释后菌液0.1ml至培养皿中，加入已融化的培养皿计数琼脂10ml，混匀。每一浓度重复3个培养皿，37℃培养48h，计数。以每皿菌落数在30-300的稀释倍数计算孢子原液的浓度。根据孢子原液的浓度，用无菌50％乙醇将孢子原液稀释到指定浓度1×106个/ml。应用液储存于灭菌容器中，4℃保存。
(3)培养基及平板的制备培养基I的制备取牛肉浸膏1.5g/L，酪蛋白胨8.5g/L，可溶性淀粉0.75g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，琼脂粉15g/L，加热融化，调pH值至7.0，121℃灭菌20min。冷却至50℃后，加入无菌的小牛血清50ml，1.6μg/mlTMP溶液10ml，混合均匀后，每个培养皿中加入上述培养基5.5ml，均匀摊布，放置水平台上，冷却凝固，备用。
培养基II的制备取牛肉浸膏1.5g/L，酪蛋白胨8.5g/L，可溶性淀粉0.75g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，对氨基苯甲酸0.2g/L，琼脂粉15g/L，加热融化，调pH值至7.0，121℃灭菌20min。冷却至50℃后，加入无菌的小牛血清50ml，1.6μg/mlTMP溶液10ml，混合均匀后，每个培养皿中加入上述培养基5.5ml，均匀摊布，放置水平台上，冷却凝固，备用。
(4)新霉素纸片的制备取直径为7mm滤纸纸片200枚放入1个洁净青霉素瓶中，121℃灭菌15min，37℃干燥后，加入500μg/ml新霉素(购自中国兽药监察所，含量为709IU/mg，生产批号3099310)溶液2ml，使每1片纸片浸润，4℃平衡过夜。37℃干燥后，密封，室温(22-25℃)储存。每1纸片含新霉素5μg。
(5)甲氧苄啶补充液的配制准确称取甲氧苄啶标准品(含量为99.87％)10.01mg，加入80ml无菌20％乙醇，充分混合，并定容至100ml，成浓度为100μg/ml的甲氧苄啶标准储备液。取上述甲氧苄啶标准储备存液1ml，用无菌10％氯化钠稀释定容至50ml，成浓度为2μg/ml的甲氧苄啶补充液，-20℃保存。
实施例3、本发明试剂盒使用的操作程序3.1本发明试剂盒操作步骤第1步仔细检查培养箱的温度，将温度设为44～45℃，培养箱内放置一广口瓶，装水约120ml。从冰箱中取出培养基及菌液，放置室温。
第2步将待检样品放置于干净的托盘中，用一把洁净的手术刀组织样(肾脏、肌肉、肝脏)快速切开，切口约2cm深。注意切面保持平整。
第3步；取出无菌的棉拭子后，将两支棉拭子从切口处垂直插入待测组织中，并稍用力将切面夹紧，使棉拭子头充分接触组织。棉拭子放置于组织中至少30min，直至棉拭子吸满组织液。
第4步在设有培养基的培养皿外侧用记号笔做一参照标记，作为涂拭巨大芽孢杆菌菌种的起点。检查盛芽孢瓶子的盖子是否旋紧。密封后，剧烈摇动芽孢悬液，使芽孢混合均匀。打开盛芽孢瓶瓶盖，插入无菌棉拭子，待棉拭子完全浸透后取出。将盛芽孢瓶的瓶盖旋紧，用封口膜再次密封。注意不要重复使用棉拭子。
第5步涂拭菌液的过程如附图6。
第6步打开盛新霉素的瓶盖，用镊子取出纸片，在距培养皿做记号的边缘12～13mm的位置放置一片新霉素纸片，用镊子轻压纸片，使纸片完全贴在培养基上。注意新霉素纸片放置好后，不要挪动新霉素纸片的位置，若纸片位置不合适，应重新取培养基进行涂拭。
第7步检查棉拭子头在组织中是否吸收饱和，待吸满后取出，用剪刀将棉拭子杆剪断，剩约10～15mm长，分别放置于已涂拭菌液的培养基(培养基I和培养基II)表面(呈兔耳状)，棉拭子头应远离新霉素纸片。每个培养皿放置两个棉拭子(即可测定两个样品)，放好后注意用镊子轻压棉拭子杆以固定。见附图7。
第8步向放好棉拭子上用移液器吸取50μL的甲氧苄啶溶液滴至棉拭子上，将制备好的培养皿放置于培养箱内，温度44℃。将本试剂盒培养5h，不应超过12h，判定结果。
第9步小心将培养皿从培养箱中取出，仔细检查培养基I和培养基II表面细菌生长情况。观察培养基表面是否有部分细菌生长。若有，继续下步操作；若没有，可能是材料或操作存在问题。
第10步仔细检查新霉素纸片周围区域，纸片周围透明清晰的区域称为抑菌圈。该圈主要用作指示试剂盒是否有效的阳性对照，若纸片周围没有抑菌圈，表明试剂盒材料存在问题或操作不当。用塑料直尺量取抑菌圈的直径，若抑菌圈的直径在20mm以下，表明实验操作存在问题，应重新进行实验。
第11步仔细检查棉拭子头周围的区域，棉拭子头周围存在透明清晰的区域称为抑菌圈。此抑菌圈的产生是因为棉拭子头中的磺胺类药物扩散至培养基中抑制细菌的生长而产生。棉拭子头周围有抑菌圈表明测定结果为阳性。棉拭子头处均长满了细菌表明肾组织液中没有残留。棉拭子头周围不存在抑菌圈表明测定结果为阴性。
3.2本发明试剂盒结果判定若新霉素纸片在培养基I和II上所产生的抑菌圈直径20～26mm内，则可以进行结果判定(见图1和图2)。
在培养基I和II上，棉拭子周围均无抑菌圈，结果判定为阴性。
棉拭子在培养基I上有清晰抑菌圈，在培养基II上无抑菌圈，抑菌圈直径≥6mm者，结果判定为阳性，表明有磺胺类药物残留。
棉拭子在培养基I和II均有清晰抑菌圈，则表明有除磺胺类药物以外其他药物残留。
实施例4、试剂盒的灵敏度、量-反应关系、准确度、精确度、假阴性率、稳定性实验(1)试剂盒的灵敏度试验准确称取磺胺类药物标准品(如表4所述)，用0.1moL/L氢氧化钠溶液溶解并用蒸馏水稀释成浓度为1000μg/ml标准贮备液。选择6种不同来源的均质的空白猪肌肉及肾脏组织(以下实施例相同)，每份组织各5g，加入磺胺类药物各0.5ml，使待测组织中磺胺类药物浓度分别达到0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4μg/g，静置30min，加灭菌的磷酸缓冲液(磷酸盐缓冲液(pH7.0)的配制如下磷酸氢二钾21.8g和磷酸二氢钾17.1g溶解，并定容至1000ml蒸馏水)9.5ml，漩涡混合5min，室温静置30min，在4000r/min下离心10min，取上清液供培养基I检测，同时取标准溶液(磺胺类药物浓度依次为0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4μg/ml)测定。每个浓度设5个重复，共测定30次。以30次测定结果均为阳性者的最小浓度为最低检测限。本试验的检测结果见表4。由表4可看出本发明的试剂盒对猪肌肉和肾脏组织中6种磺胺类药物的最低检测限为0.025～0.1μg/g。本发明试剂盒与同类试剂盒CAST、FAST试剂盒对磺胺类药物标准溶液的最低检测限的比较见图3所示。
表4本发明的方法对在标准溶液和猪组织中磺胺类药物的最低检测限试验结果

(2)试剂盒的量-反应关系试验称取均质的空白猪肌肉、肾脏组织样品5g，加入磺胺类药物标准工作液(如上所述)0.5ml，使组织中药物浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、4μg/g，经制样，取上清液供培养基I检测。每种浓度5个重复，测定5次。将测得的抑菌圈直径与相应对数浓度线性拟合，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。表5显示了本发明的试剂盒对6种磺胺类药物实测的标准曲线线性范围和相关系数，表明在0.1～4μg/ml(g)浓度范围内，本发明试剂盒对猪肌肉、肾脏组织中6种磺胺类药物测定的相关系数均在0.9以上，具有良好的线性关系。
表5本发明试剂盒对6种磺胺类药物测得的标准曲线线性范围和相关系数


结果表明，根据本发明的轮胎非常明显地减少了侧壁的中空变形。
图6示出了对于变化“A”(实线)和“I”(虚线)来说侧壁的变形值，其为侧壁上的角位置函数；与上面给出值不同，这些曲线是通过具有“预先处理”的连接区域的轮胎而获得；它们的位置如箭头所示。
图7和8示出了根据本发明的方法的一个实施例。
图7示意性地示出了一个帘布层160，其具有两个翼片161。当然，图中示出的翼片已被放大，以便更好地示出根据本发明的方法的原理。
图8示出了根据本发明的方法的两个阶段。
在第一阶段(图8(a))，用于形成胎体加强元件的帘布层160被缠绕在一个成型鼓(图中未示出)上，以便获得帘布层边缘的重叠部分170，所述重叠部分170平行于成型鼓的轴线180。
然后(图8(b))，通过将翼片161沿着由帘布层160边缘限定的直线折叠，将翼片161折叠过来，其中翼片161从所述边缘上伸出。
这样，形成了一个具有连接区域的胎体层，如图8(c)所示，连接区域设置有覆盖条。
图9示意性地通过剖面示出了所获得的连接区域，以及形成覆盖条的折叠翼片161。
如图7中所示的情况，没有必要使用预先切除的帘布层。本领域的普通技术人员可以理解，当帘布层被缠绕在制造成型鼓上时，可以对其进行切除。
表8本发明的试剂盒对猪肾脏和肌肉组织中的假阴性率(％)

(5)试剂盒的稳定性试验1)新霉素纸片的稳定性试验将本发明制备的新霉素纸片储存于2～8℃，每月取新霉素纸片测定其抑菌圈直径。取新制备的培养基(该培养基成分及含量如下蛋白胨6g、胰蛋白胨4g、牛肉浸膏1.5g、酵母浸膏3g、葡萄糖1g，溶解于1000ml蒸馏水中溶解，调节pH为7.3，加入琼脂粉15g，湿热灭菌即得)，涂布新配制的枯草芽孢杆菌孢子液(Bacillus subtilis，ATCC6633，美国菌种保藏机构，罗克维尔，马里兰州(American Type Culture CollectionTM，Rockville，MD))，其孢子液浓度为1×106个/ml。取新霉素纸片3枚置于培养基表面，在29℃培养18h，测量培养基表面抑菌圈的直径是否在20～26mm范围内，作为鉴别培养基失效期的参考标准。由图4可见，本发明制备的新霉素纸片贮存2～8℃，8个月内的抑菌圈直径在21.6～23mm之间，其有效期可以定在6个月以内。
2)巨大芽孢杆菌的工作菌液的稳定性将本发明制备的孢子液浓度为1×106个/ml巨大芽孢杆菌保存于2～8℃，用菌落计数法每月测定菌液的菌落浓度，观察菌落浓度随时间变化的趋势。结果表明，孢子液的浓度略有下降，6个月内变化较小(图5)。用新制备的新霉素纸片放置于已涂布储备应用工作菌液的本发明的培养基表面，新霉素纸片抑菌圈直径在20～26mm范围内，说明菌液在6个月内是有效的。
3)试剂盒培养基的稳定性试验新制备本发明试剂盒的培养基若干，将培养皿封装于铝塑复合袋中，于室温20～25℃和2～8℃储存。每月取样，每次抽样6个培养皿，观察培养皿内培养基的感观指标。同时，每个培养皿涂拭新制备巨大芽孢杆菌应用工作菌液(1×106个/ml)，并分别用新配制的0.1μg/ml磺胺嘧啶标准溶液和新制备新霉素纸片考核。如果检测培养基没有杂菌污染，从外观上无显著的变化，而且巨大芽孢杆菌生长茂盛、均匀，新霉素纸片的抑菌圈在20～26mm范围内则判定该培养基有效。从表9和表10可见，无论是在室温还是在2～8℃供试的培养基在6个月内，培养基的感观指标无明显变化；6个月内培养基I均能检测出0.1μg/ml磺胺嘧啶标准溶液，培养基II上磺胺嘧啶不能被检出。新霉素纸片的抑菌圈直径在20～26mm范围内波动，符合规定试剂盒性能指标。
表9本发明的试剂盒中培养基□的稳定性试验

注“ND”未出现抑菌圈表10本发明的试剂盒中培养基□的稳定性试验


注ND不出现抑菌圈实施例5、动物体内残留试验表11本发明试剂盒适用性试验

说明SST培养基□上产生的抑菌圈直径；N无抑菌圈；+阳性；-阴性；ND未检出；选择品种为“长大”的断奶仔猪16头，每头猪的体重为15±2.5kg，随机分为2组，对照组4头，试验组12头。预试7天，饲喂不含任何抗菌药物的饲料。7天后进入正式试验。对照组日粮配方中不加磺胺嘧啶，试验组日粮配方中添加100mg/kg体重磺胺嘧啶。试验期间，使猪自由采食，自由饮水。连续饲喂5天后，试验组停止饲喂加磺胺嘧啶日粮。停药后0天、3天、5天、7天分别屠宰加药组猪3头和空白对照组猪1头，采集背最长肌和肾脏，同时本发明试剂盒和高效液相色谱法(HPLC)测定，考察本发明试剂盒对实际样品的检出能力。
表11中列出了本发明试剂盒和HPLC法对磺胺嘧啶实际发生样品的检测结果。用本发明试剂盒检测肌肉和肾脏中磺胺嘧啶残留，肌肉中可检出时间为停药后0天，停药后3～5天采集的肌肉样品检测均为阴性；肾脏中可检出时间为停药后5天。本发明试剂盒共检出肌肉阳性样品3份，阴性样品9份，肾脏阳性样品8份，阴性样品4份；空白组肌肉和肾脏组织均未测出。用HPLC法测定，肌肉中磺胺嘧啶可检出时间为3d，检出肌肉阳性样品为3份，低于最高残留限量的为3份，低于检测限量的样品6份；肾脏中磺胺嘧啶停药后5d仍能检出，总检出为8份，其中浓度高于最高残留限量的为7份，低于限量的样品为1份，不喂药对照组均未检出。由结果可知，本发明试剂盒对磺胺嘧啶在肌肉检测结果与HPLC法符合率为100％；与肾脏的符合率为93.75％。
权利要求
1.一种动物可食性组织中磺胺类药物残留筛选方法，包括制备培养基、巨大芽孢杆菌工作菌液、抗菌药物纸片和无菌棉拭子，其步骤如下所示1)将培养基、工作菌液、抗菌药物纸片和甲氧苄啶补充液单独制备；2)将巨大芽孢杆菌制成孢子数为1×106个/ml工作菌液；3)将抗菌药物纸片制备成直径为7mm，含新霉素5μg的纸片；4)将所述的培养基制成如下的培养基，其组分如下培养基I牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉0.75～1.5g/L磷酸二氢钾0.5～1.0g/L琼脂 15～20g/L无菌小牛血清 30～50ml/L甲氧苄啶 0.016～0.04mg/L补充水分至1L；及培养基II牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉0.75～1.5g/L磷酸二氢钾0.5～1.0/L琼脂 15～20g/L无菌小牛血清 30～50ml/L甲氧苄啶 0.016～0.04mg/L对氨基苯甲酸 0.1～0.2g/L补充水分至1L；按照以下步骤制备a)将上述培养基中的牛肉浸膏、酪蛋白胨、可溶性淀粉、磷酸二氢钾和琼脂加热融化，调pH至7.0～7.5，121℃灭菌20min，冷却至50℃；b)向步骤a)中加入灭活的无菌小牛血清和甲氧苄啶，得到培养基I；c)向步骤b)加入对氨基苯甲酸，得到培养基II；d)将步骤b)或c)的培养基分装至培养皿中，使培养基冷却，并使培养皿中培养基的厚度为1.5～2mm；6)将工作菌液均匀涂布于培养基I或II上；7)将新霉素纸片置于培养基上作阳性对照；8)用棉拭子取待测组织的样品，将其置于培养基I或II上；9)向棉拭子上滴加所述的甲氧苄啶补充液；和10)将培养基I或II置于温度44～45℃，培养5～8h，根据培养基I和II上抑菌圈的出现情况判断待测样品中是否含有磺胺类药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲氧苄啶补充液中甲氧苄啶为1.5～2μg/ml。
3.权利要求1或2所述的一种动物可食性组织中磺胺类药物残留筛选方法的试剂盒，包括培养基、巨大芽孢杆菌工作菌液、抗菌药物纸片和无菌棉拭子，其特征在于，所述的工作菌液为孢子数为1×106个/ml的巨大芽孢杆菌菌液，所述的抗菌药物纸片为5μg新霉素/∮7mm，所述的补充液为甲氧苄啶液，所述的培养基为培养基I和培养基II联用的培养基，按照以下组分配制培养基I牛肉浸膏1.5～3g/L酪蛋白胨8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氢钾 0.5～1.0g/L琼脂15～20g/L无菌小牛血清30～50ml/L甲氧苄啶0.016～0.04mg/L补充水分至1L；培养基II牛肉浸膏1.5～3g/L酪蛋白胨8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氢钾 0.5～1.0/L琼脂15～20g/L无菌小牛血清30～50ml/L甲氧苄啶0.016～0.04mg/L对氨基苯甲酸0.1～0.2g/L补充水分至1L；按照以下步骤制备a)将上述培养基中的牛肉浸膏、酪蛋白胨、可溶性淀粉、磷酸二氢钾和琼脂加热融化，调pH至7.0～7.5，121℃灭菌20min，冷却至50℃；b)向步骤a)中加入灭活的无菌小牛血清和甲氧苄啶，得到培养基I；c)向步骤b)的培养基中加入对氨基苯甲酸，得到培养基II；d)将步骤b)或c)的培养基分装至培养皿中，使培养基冷却，并使培养皿中培养基厚度为1.5～2mm。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于补充液中的甲氧苄啶为1.5～2μg/ml。
5.权利要求3或4所述的试剂盒在体外检测动物可食性组织中磺胺类药物残留中的应用。
全文摘要
本发明属于农产品残留抗菌素检测技术领域，具体地，本发明涉及一种利用微生物学方法，检测动物可食性组织中磺胺类药物残留的方法及其试剂盒。其方法包括制备培养基I和培养基II，用巨大芽孢杆菌作工作菌液，新霉素纸片作质控用的抗菌素纸片，甲氧苄啶作增效用的补充液，将培养基I和培养基II联用，用棉拭子粘取待测动物组织样品，并向棉拭子上滴少许甲氧苄啶补充液，然后将其与所述的培养基接触培养。根据棉拭子周围出现抑菌圈的有无判定检测结果。本发明还公开了应用上述方法的专用试剂盒。与现有技术相比，本发明的优点是检测方法简便，灵敏度高，试剂盒存放时间长，适合高通量的样品筛选。
文档编号C12Q1/04GK1858232SQ20061001864
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月27日 优先权日2006年3月27日
发明者袁宗辉, 伍金娥, 王玉莲, 谢长清, 余欢, 陈冬梅, 陶燕飞, 刘振利, 黄玲利, 常超 申请人:华中农业大学