专利名称：一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法
技术领域：
本发明涉及一种谷子育种材料类型的划分方法，具体涉及一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，属于作物品种分类研究领域。
背景技术：
传统的谷子育种材料分类方法是按照育种材料的某一方面的特征特性而进行划分的，如按育性可分为正常可育材料和雄性不育系，按株型可分为紧凑型、半紧凑型和披散型，按适宜种植季节分为春谷、夏谷，按生育期分为早熟、中熟和晚熟等等。近些年来随着生物技术的发展，学者们通过构建进化树研究谷子种质资源间亲缘关系，并据此研究种质资源遗传进化关系，进而研究各类群与生态类型、地理来源关系的报道，如2006年王节之等(生物技术，2006，16 (I) 10-14)利用SSR引物，通过构建进化树研 究来自全国不同生态区的96份谷子品种资源的遗传进化关系，将谷子育种材料分为5个类群，但并没能得出遗传类群与生态类型具有一致性的结论。2009年贾小平等(Theor ApplGenet, 2009,118 :821-829)也利用进化树进行谷子种质资源的遗传进化方面的研究，依据研究者对供试材料的认识，将供试材料的进化树纵切的遗传相似系数确定为0. 77或0. 8，在遗传相似系数为0. 77时，供试材料被划分为2个类群；在遗传相似系数为0. 8时,供试材料被划分为5个类群，由于不能确定对进化树进行纵切的特定遗传相似系数，因此，不能得出理想的遗传进化研究结果。并且所有的这些研究均是基于细胞核的遗传信息开展的，到目前为止，未见基于细胞质遗传信息对谷子育种材料进行类型划分的报道。
发明内容
本发明是为了克服上述技术缺陷而提供一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法。本发明的原理是根据谷子细胞质中线粒体遗传保守，呈典型母系遗传的特点，利用线粒体特异引物，扩增其非编码区，对线粒体进行多态性分析，据此构建基于分子水平的谷子育种材料细胞质来源进化树；通过系谱追踪，构建谷子育种材料的母本衍生进化图；依据母本衍生进化图，通过母本衍生进化图和细胞质来源进化树的比较分析，确定对谷子育种材料细胞质来源进化树纵切的特定遗传相似系数，并对其细胞质来源进行分子聚类；将细胞质来源分子聚类图与母本衍生进化图结合，确定各类群材料的细胞质类型。本发明的特点是将谷子育种材料细胞质来源进化树与谷子育种材料的母本衍生进化图结合，确定对进化树进行纵切的特定遗传相似系数，从而达到对谷子育种材料的细胞质进行了分类的目的。本发明提供的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于包括如下步骤(I)细胞质来源进化树的构建；(2)母本衍生进化图的构建；(3)特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类；(4)谷子育种材料细胞质类型的确定。一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(I)所述的细胞质来源进化树的构建包括如下步骤①叶片组织的培养与获取将谷子育种材料的种子种于育苗盘中获得谷子幼苗，于4叶期分别剪取育种材料的叶片组织；②全基因组DNA的提取采用CTAB法提取步骤①中叶片组织的全基因组DNA ；③PCR扩增采用20 Ul反应体系，利用线粒体特异引物对步骤②提取的基因组DNA进行37个反应循环PCR扩增；④多态性检测利用凝胶电泳法对步骤③中线粒体的PCR扩增产物进行多态性检测；⑤细胞质来源进化树的生成对步骤④中电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，生成由“I”和“0”组成的原始矩阵，用NTSYS-PC2. I软件进行数据分析，用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，生成细胞质来源的进化树。 所述的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建为利用系谱追踪法将谷子育种材料按步骤(I)中进化树的排列顺序进行纵向排列，通过逐代向上追踪育种材料的母本，直到追踪到农家品种为止，依据系谱将同一母本衍生的育种材料按照衍生关系逐步连接起来，形成母本衍生进化图。所述的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类为将步骤(2)构建的谷子育种材料的母本衍生进化图与步骤(I)中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树相结合，并进行比较分析，确定基本能将同一母本衍生系统聚为一个分枝的特定遗传相似系数，在该遗传相似系数下对步骤(I)中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树进行纵切，将谷子育种材料进行胞质来源的分子聚类，分子聚类中每个分枝代表一个胞质类群。所述的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(4)所述的谷 子育种材料细胞质类型的确定是将步骤(3)中的分子聚类图与步骤(2)中构建的母本衍生进化图结合，将胞质来源分子聚类图中的每个分枝与对应的母本衍生系统逐一进行对比，确定每个类群材料的细胞质类型，完成对谷子育种材料细胞质类型的划分。所述的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(I)所述的细胞质来源进化树的构建中步骤①中所述的谷子育种材料为延谷12、长高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、坝谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、郑9188、大同28、铁8240、锦谷12、锦谷14、朝438、公谷68、铁487、铁谷6、复532、晋汾I、沧156、济谷13、长高229A、S80、冀谷29、公谷70、石206065、大同29绿、安2491、兴谷88、晋15、晋汾3、沧344、Y61、石 02399、C138、C208、朝谷 12、K523、L70、铁大粒黄、K359、朝谷 13、谷 83、衡 968、济 9403、冀谷 27、济 9409、鲁谷 10、济谷 12、济谷 11、谷 6、石 02521、石 98700、石 207382、石 207393、石 02530、石 207286、安 4852、谷 3、冀谷 25、石 207191、长高 146A、石 207226、石 206058、公谷 65X164,203184 早、安 2367、石 202242、谷 57、冀谷 24、谷丰 2 号、石 06-439、谷 38、小香米、冀谷19、K1130、坝谷214-2、谷11、K1011、长农36、冀谷28、长农35、晋谷35、太选5号、太选2号、晋谷21、谷95、晋谷29、朝谷14、K660、美国大头、谷10、K546、朝绿-I、晋谷16、石98622和石97672共111份。所述的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建中111份谷子育种材料中12份来源于同一母本材料沁源母鸡嘴、13份材料来源于同一母本材料黄软谷、63份材料来源于同一母本材料日本60日、6份材料来源于同一母本材料硬穗谷、5份材料来源于同一母本材料黑枝谷，12份材料未追踪到其母本，便于研究命名为系谱丢失I型和系谱丢失II型。所述的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中特定遗传相似系数为0. 74，在该遗传相似系数下对步骤(I)中所述的细胞质来源进化树的构建中所构建的进化树进行纵切，将其纵切为7个分枝，每个分枝代表I个胞质来源的分子类群，这样将胞质来源进化树纵切为7个类群，纵切结果与母本衍生进化图一致性达98. 2%。所述的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类型的确定中将步骤(3)中所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中构建的分子聚类图与步骤(2)中所述的母本衍生进化图的构建中所构建的母本衍生进化图相结合，进行逐一对比，确定各类群材料的胞质类型，分别为来源于“沁园母鸡嘴”的Q型，来源于“日本60日”的R型，来源于“黄软谷”的H型，来源于“硬穗谷”的Y型，来源于“黑枝谷”的S型，还有两种由于系谱丢失，追踪不到母本来源，分别定名 为M I型和M II型。有益效果利用本发明方法可将谷子育种材料的细胞质类型进行划分，如对我国目前杂优利用研究中具有较大利用价值的111份谷子育种材料按本发明可分为7个类型来源于“泌园母鸡嘴”的Q型，来源于“日本60日”的R型，来源于“黄软谷”的H型，来源于“硬穗谷”的Y型，来源于“黑枝谷”的S型，还有两种由于系谱丢失，追踪不到母本来源，分别定名为M I型和M II型，并且划分的7种类型的分子聚类结果与系谱追踪结果一致性高达98. 1%，为培育不同细胞质类型的不育系和杂交种奠定了基础。
图1-1和图1-2是谷子育种材料线粒体的PCR扩增多态性检测图谱；图中，M为Marker ;V1_V111分别代表111份谷子育种材料延谷12、长高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、坝谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、郑9188、大同28、铁8240、锦谷12、锦谷14、朝438、公谷68、铁487、铁谷6、复532、晋汾I、沧156、济谷13、长高229A、S80、冀谷29、公谷70、石206065、大同29绿、安2491、兴谷88、晋15、晋汾3、沧344、Y61、石 02399、C138、C208、朝谷 12、K523、L70、铁大粒黄、K359、朝谷 13、谷 83、衡 968、济 9403、冀谷 27、济 9409、鲁谷 10、济谷 12、济谷 11、谷 6、石 02521、石 98700、石 207382、石 207393、石 02530、石 207286、安 4852、谷 3、冀谷 25、石 207191、长高 146A、石 207226、石206058、公谷 65X164,203184 早、安 2367、石 202242、谷 57、冀谷 24、谷丰 2 号、石 06-439、谷38、小香米、冀谷19、K1130、坝谷214-2、谷11、K1011、长农36、冀谷28、长农35、晋谷35、太选5号、太选2号、晋谷21、谷95、晋谷29、朝谷14、K660、美国大头、谷10、K546、朝绿-I、晋谷16、石98622、石97672的DNA ；A为标准条带，“带”的颜色深于或同于“A”的条带记为“1”，浅于1”的条带记为“0”。图2-1、2_2和2-3是111份谷子育种材料的细胞质来源进化树的三个组成部分，
三者按顺序拼接在一起即得进化树全图中，0.55,0. 66,0. 78,0. 89、I. 00 为遗传相似系数图3-1、3_2和3-3是111份谷子育种材料的母本衍生进化图的三个组成部分，三者按顺序拼接在一起即得母本衍生进化图全图；图中，用实线连接的是母本来源明确的材料；用虚线连接的是母本来源不明确，但分子聚类将它们与相应的实线部分聚为一个类群的材料；沁源母鸡嘴、黄软谷、日本60日、硬穗谷、黑枝谷、系谱丢失I型和系谱丢失II型代表育种材料不同母本的来源。图4-1、4_2和4-3是111份谷子育种材料的细胞质来源的分子聚类图的三个组成部分，三者按顺序拼接在一起即得分子聚类图全图；图中，0. 55,0. 66,0. 78,0. 89、I. 00为遗传相似系数；L代表对进化树进行纵切的特定遗传相似系数0. 74 ;B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7表示在特定遗传相似系数0. 74下对进 化树纵切后形成的7个分子类群。图5是谷子育种材料细胞质类型划分中，BI分子类群和沁源母鸡嘴母本衍生系统对应，定位Q型；B2分子类群和黄软谷母本衍生系统对应，定位H型；B3分子类群和日本60日母本衍生系统对应，定位R型；B4分子类群和硬穗谷母本衍生系统对应，定位Y型；B5分子类群对应的母本衍生系统系谱丢失，定位M I型；B6分子类群和黑枝谷母本衍生系统对应，定位S型；B7分子类群对应的母本衍生系统系谱丢失，定位M II型；a对应图4-1，b对应图4-2，c对应图4_3 ;d对应图3-1，e对应图3-2，f对应图3-3。下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例中所用试剂如无特别说明均购自生工生物工程上海有限公司，所用线粒体特异引物由生工生物工程上海有限公司合成，所用NTSYS-pc2. I软件由State Universityof New York, Stony Brook研制,所用111份谷子育种材料来自我国华北夏谷生态区、西北春谷生态区、东北春谷生态区的河北、河南、山东、辽宁、吉林、山西、内蒙、陕西8个省区(详见表I)。表I 111份谷子育种材料的一览表
权利要求
1.一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于包括如下步骤(1)细胞质来源进化树的构建；(2)母本衍生进化图的构建；(3)特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类；(4)谷子育种材料细胞质类型的确定。
2.根据权利要求I一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(I)所述的细胞质来源进化树的构建包括如下步骤 ①叶片组织的培养与获取将谷子育种材料的种子种于育苗盘中获得谷子幼苗，于4叶期分别剪取育种材料的叶片组织； ②全基因组DNA的提取采用CTAB法提取步骤①中叶片组织的全基因组DNA； ③PCR扩增采用20Ul反应体系，利用线粒体特异引物对步骤②提取的基因组DNA进行37个反应循环PCR扩增； ④多态性检测利用凝胶电泳法对步骤③中线粒体的PCR扩增产物进行多态性检测； ⑤细胞质来源进化树的生成对步骤④中电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“ I ”，同一位置没有出现的带记为“0”，生成由“ I ”和“0”组成的原始矩阵，用NTSYS-pC2. I软件进行数据分析，用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，生成细胞质来源的进化树。
3.根据权利要求I一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建为利用系谱追踪法将谷子育种材料按权利要求2中所述的细胞质来源进化树的构建中所构建进化树的排列顺序进行纵向排列，通过逐代向上追踪育种材料的母本，直到追踪到农家品种为止，依据系谱将同一母本衍生的育种材料按照衍生关系逐步连接起来，形成母本衍生进化图。
4.根据权利要求I的一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类为将权利要求3中所述的母本衍生进化图的构建中所构建的谷子育种材料的母本衍生进化图与权利要求2中所述的细胞质来源进化树的构建中所构建的进化树相结合，并进行比较分析，确定基本能将同一母本衍生系统聚为一个分枝的特定遗传相似系数，在该遗传相似系数下对权利要求2中所述的细胞质来源进化树的构建中所构建的进化树进行纵切，将谷子育种材料进行胞质来源的分子聚类，分子聚类中每个分枝代表一个胞质类群。
5.根据权利要求I一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类型的确定为将权利要求4中所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中所形成的分子聚类图与权利要求3中所述的母本衍生进化图的构建中所构建的谷子育种材料的母本衍生进化图相结合，将胞质来源分子聚类图中的每个分枝与对应的母本衍生系统逐一进行对比，确定每个类群材料的细胞质类型，完成对谷子育种材料细胞质类型进行划分。
6.根据权利要求2—种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(I)所述的细胞质来源进化树的构建中步骤①中所述的谷子育种材料为延谷12、长高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、坝谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、郑9188、大同28、铁8240、锦谷12、锦谷14、朝438、公谷68、铁487、铁谷6、复532、晋汾I、沧156、济谷13、长高229A、S80、冀谷29、公谷70、石206065、大同29绿、安2491、兴谷88、晋15、晋汾3、沧·344、Y61、石 02399、C138、C208、朝谷 12、K523、L70、铁大粒黄、K359、朝谷 13、谷 83、衡 968、济 9403、冀谷 27、济 9409、鲁谷 10、济谷 12、济谷 11、谷 6、石 02521、石 98700、石 207382、石 207393、石 02530、石 207286、安 4852、谷 3、冀谷 25、石 207191、长高 146A、石 207226、石.206058、公谷 65X164,203184 早、安 2367、石 202242、谷 57、冀谷 24、谷丰 2 号、石 06-439、谷38、小香米、冀谷19、K1130、坝谷214-2、谷11、K1011、长农36、冀谷28、长农35、晋谷35、太选5号、太选2号、晋谷21、谷95、晋谷29、朝谷14、K660、美国大头、谷10、K546、朝绿-I、晋谷16、石98622和石97672共111份。
7.根据权利要求3—种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建中111份谷子育种材料中12份来源于同一母本材料沁源母鸡嘴、13份材料来源于同一母本材料黄软谷、63份材料来源于同一母本材料日本60、6份材料来源于同一母本材料硬穗谷、5份材料来源于同一母本材料黑枝谷，12份材料未追踪到其母本，便于研究命名为系谱丢失I型和系谱丢失II型。
8.根据权利要求4一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中特定遗传相似系数为0. 74，在该遗传相似系数下对权利要求2、6中所述的细胞质来源进化树的构建中所构建的进化树进行纵切，将其纵切为7个分枝，每个分枝代表I个胞质来源的分子类群，这样将胞质来源进化树纵切为7个类群，纵切结果与母本衍生进化图一致性达98. 2%。
9.根据权利要求5—种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类型的确定中将权利要求4、8中所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中构建的分子聚类图与权利要求3、7中所述的母本衍生进化图的构建中所构建的母本衍生进化图相结合，进行逐一对比，确定各类群材料的胞质类型，分别为来源于“泌园母鸡嘴”的Q型，来源于“日本60日”的R型，来源于“黄软谷”的H型，来源于“硬穗谷”的Y型，来源于“黑枝谷”的S型，还有两种由于系谱丢失，追踪不到母本来源，分别定名为M I型和M II型。
全文摘要
本发明公开了一种谷子育种材料细胞质类型的划分方法，其特征在于包括以下步骤(1)细胞质来源进化树的构建；(2)母本衍生进化图的构建；(3)特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类；(4)谷子育种材料细胞质类型的确定。本发明为培育不同细胞质类型的不育系和杂交种奠定了基础，为创制不同细胞质类型的谷子不育系，培育不同细胞质类型的谷子杂交种奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK102750458SQ20121020360
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者刘正理, 夏雪岩, 师志刚, 张婷, 张梅申, 张永信, 李伟, 程汝宏 申请人:河北省农林科学院谷子研究所