专利名称：霍乱弧菌(vc)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及致病菌的生物检测技术，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
背景技术：
霍乱弧菌(V. cholera)是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚 高，属于国际检疫传染病。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或食物尤其是水产品经口感染。近年来随着国家贸易全球化的不断加剧，我国的进出口贸易逐年增长。而在进口的食品中，出现问题最多的是鲜活或冰冻的水产品。例如，2005年和2006年进口水产品中副溶血性弧菌的检出率为9%左右，霍乱弧菌的检出率为2% 3%,其他的弧菌如创伤弧菌等也时有检出。而且我国长期以来所形成的饮食习惯，对一些水产品如龙虾、象拔蛘和三文鱼等一般生吃，从而对消费者的健康造成潜在威胁，所以有必要加强对水产品中常见致病性弧菌的检测。霍乱弧菌包含多种毒力相关因子，其中霍乱毒素(CT)是其主要的致病因子。自环境中分离出的霍乱弧菌多数不产生CT。01群和0139群霍乱弧菌是引起疾病发生的两种主要血清型，另外，近年来的研究显示部分非01、非0139的霍乱弧菌也可以产生CT。因此，分离鉴定食品中的霍乱弧菌对保护人民健康，保障水产品的安全具有重要的意义。目前常用的霍乱弧菌检测方法包括1)传统的培养方法。总体可分为4个阶段或步骤。预增菌，选择性增菌，分离，生化鉴定。需要4 7天，才能得出明确的诊断结果。2)免疫标记技术。利用抗原抗体的特异性反应，并结合一些生物化学或物理学方法进行检测，但该方法的灵敏度和特异性均较差。3)分子生物学检测方法。目前有PCR技术，实时荧光定量PCR和LAMP方法。以上几种方法易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，并且不能区分活菌和死菌，阻碍了其大规模推广使用。实时突光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplification and Testing,简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42°C )，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和I7RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类致病菌的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析致病菌的特性进行专门设计。目前尚无针对霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。
发明内容
为解决现有的霍乱弧菌(VC)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。本发明所提供的霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝的VC检测引物17和nT7，和一条用于与在I7RNA聚合酶作用下根据所述VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VC检测探针。所述捕获探针可与如序列表中序列I所示的霍乱弧菌(VC)的靶标核酸(VC RNA)序列特异结合，在有VC内标(VC IC RNA)时，其最好还可与该VC内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述VC检测引物由T7引物和n!7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述VC检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录 酶和I7RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述17弓丨物、nT7引物和VC检测探针存在于一 VC检测液中。再进一步所述试剂盒还包含有VC内标和内标检测探针；所述VC内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与VC靶标核苷酸(VC RNA)使用同一对引物(17和nT7)，VC内标由序列表中序列7所示的VC IC RNA ;所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示,5’端标记HEX突光基团,3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于VC检测液中。更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、VC反应液、VC检测液、SAT酶液、VC阳性对照、VC阴性对照和VC内标，其中裂解液含硫酸铵((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕获探针和磁珠；洗涤液含NaCl和SDS ；VC 反应液含 dNTP 和 NTP ；VC检测液含T7引物、nT7引物、VC检测探针和内标检测探针；SAT酶液含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；VC阳性对照；含霍乱弧菌(VC) toxR基因的体外转录RNA稀释物；VC阴性对照不含有霍乱弧菌(VC)靶标核酸(VC RNA)序列或不含有霍乱弧菌的溶液,如生理盐水；VC内标含VC内标RNA(序列如序列表中序列I所示)稀释物。具体的，所述试剂盒中一个反应单位中上述各种试剂组成如下(I)裂解液HEPES 25-250mM, (NH4) 2S045_50mM ;(2)核酸提取液HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM，捕获探针1-50 u M (优选为 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (优选为 50-250mg/L)；(3)洗涤液HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1% SDS, EDTA I-IOmM ；(4) VC 反应液Tris 10_50mM, MgCl2 10_40mM，dNTP 0. I-IOmM(优选为 0. 5_5mM)，NTP l-20mM(优选为 1-lOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
(5)VC检测液将VC检测引物和VC检测探针溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImMEDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-15pmol/反应均可；其中17引物浓度优选为12. 5pmol/反应，n!7引物浓度优选为12. 5pmol/反应，VC检测探针浓度优选为5pmol/反应’内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；(6) SAT 酶液=M-MLV 反转录酶 400-4000U/ 反应(优选为 500-1500U/ 反应)、T7 RNA 聚合酶 200-2000U/ 反应(优选为 500-1000U/ 反应)、2_10mM HEPES pH7. 5、10-100mMN-acetyl-L_cysteine、0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5mM EDTA、0. 1-1% (v/v) Triton X-100和 20-50% (v/v) glycerol ；(7) VC阳性对照；含IO5-IO8拷贝/mL霍乱弧菌(VC) toxR的体外转录RNA稀释物；
⑶VC阴性对照不含有霍乱弧菌(VC)靶标核酸(VC RNA)序列或不含有霍乱弧菌的溶液；(9) VC内标含IO5-IO8拷贝/mL VC IC RNA (序列如序列表中序列7所示)体外转录RNA稀释物。另一种更具体形式，所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述VC反应液、VC检测液、SAT酶液、VC阳性对照、VC阴性对照及VC内标。所述VC阳性对照中的体外转录的VC RNA以下述方法制备I)用化学合成法合成VC toxR中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；2)将片段克隆到pGEM -T载体中，构建VC阳性对照质粒；3) VC阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5 a中，命名为pGEM -T-VC菌株，贮存于-70。。4)从pGEM -T-VC菌株中提取pGEM -T-VC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。所述VC内标中的体外转录的VC IC RNA以下述方法制备I)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同VC靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；2)将片段克隆至ljpGEM -T载体中，构建VC内标质粒；3)VC内标质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM _T_VC IC菌株，贮存于-70。。； 4)从pGEM -T-VC IC菌株中提取pGEM -T-VC IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。所述霍乱弧菌(VC)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一(I)可与序列表中序列I所示的霍乱弧菌(VC)的靶标核酸(VC RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO,Target Capture Oligo),所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；(2)用于在M-MLV反转录酶作用下产生VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝的VC检测引物17和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；(3)用于与在I7RNA聚合酶作用下根据所述VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VC检测探针，所述VC检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；(4)内标和内标检测探针，内标为VC核苷酸序列(VC RNA)的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和n!7引物)，内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示VC IC RNA,内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。所述试剂盒的使用方法，用于霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作
I)用裂解液裂解待测样品中的霍乱弧菌(VC)，得到含有霍乱弧菌(VC)核酸的裂解液；2)向步骤I)的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在VC内标时，同时加入VC内标，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到霍乱弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ；3)将步骤2)提取的霍乱弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA加入由VC反应液和VC检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3 I ；4)根据荧光信号产生的时间和强度参照VC阳性对照、VC阴性对照和VC内标检测结果对待测样品进行定性检测。本发明提供了一种霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有的VC检测相比，具有以下优点(I)高特异性、高纯度、低污染针对VC靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获VC的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。(2)快速检测将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50分钟。(3)污染易控与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。(4)设备简单，成本低与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。综上所述，本发明试剂盒能够检测食品中的VC RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达100CFU/ml)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(50分钟完成扩增检测)的特点，将在霍乱弧菌快速检测中发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图I显示灵敏度的检测结果图2显示阴性特异性参考品的检测结果图3为食品样本的靶标荧光检测结果图4为食品样本的内标荧光检测结果
具体实施例方式本发明霍乱弧菌(VC)检测技术，将特异性靶标捕获技术与实时荧光核酸恒温扩增(SAT)技术结合而形成。由于霍乱弧菌包括的亚型较多，如常见的01、0139，所以要覆盖如此多的亚型，在 检测靶标的选择上就必须考虑试剂盒对各亚型检测的通用性，因此必须选择在各个亚型之间保守性较强的基因作为检测靶标。霍乱弧菌各亚型之间保守性强的基因为toxR，因此本发明的发明人通过研究分析确定了 toxR上一段保守性强的序列作为检测靶标。本发明通过设计专用的捕获探针，高效、特异性捕获VC的RNA;核酸扩增使用M-MLV反转录酶和17 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，17 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。本发明中的专用引物和探针包括(I)捕获探针一条可与序列表中序列I所示的霍乱弧菌(VC)的靶标核酸(VCRNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，在有VC内标(VC IC RNA)时，其还可与该VC内标序列特异结合；所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示。(2) VC检测引物一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝的VC检测引物，所述VC检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；(3) VC检测探针一条用于与在I7RNA聚合酶作用下根据所述VC靶标核酸(VCRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VC检测探针，所述VC检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。为便于进行结果分析，还包括(4) 一条内标检测探针和VC内标，内标检测探针为在使用VC内标时与该内标配合使用的内标检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；VC内标为VC核苷酸序列(VC RNA)的竞争性内标，同时与所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物CT7和n!7引物)。VC内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名为VC IC RNAdC含义为内标)。基于以上设计，本发明进一步提供一种霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒，至少包含所述捕获探针(序列2)，一对所述T7引物(序列3)和n!7引物(序列4)，以及一条所述VC检测探针(序列5)。进一步，所述试剂盒还可包含有M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述17引物、nT7引物和VC检测探针存在于VC检测液中。再进一步，所述试剂盒还可包含竞争性VC内标(序列7)和内标检测探针(序列6)，所述的内标检测探针存在于VC检测液中。更具体来讲，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、VC反应液、VC检测液、SAT酶液、VC阳性对照、VC阴性对照和VC内标，各组分说明如下(I)裂解液用于裂解和保存待测样品中的霍乱弧菌(VC)，为含有去垢剂和HEPES缓冲液的溶液，去垢剂主要为硫酸铵((NH4)2S04，优选为5-50mM)；
(2)核酸提取液用于提取和纯化VC菌体RNA，为含捕获探针1-50 iiM(优选为5-25 u M)和磁珠50-500mg/L(优选为50_250mg/L)的水溶液；(3)洗涤液用于磁珠清洗，为含Iwt % SDS的水溶液。(4) VC反应液SAT扩增所需组分，含dNTP 0. I-IOmM(优选为0. 5_5mM)和NTPl-20mM(优选为I-IOmM)的水溶液；(5) VC检测液含SAT扩增所需引物和探针的水溶液，各引物或探针的浓度在5-15pmol/反应均可，其中17引物浓度优选为12. 5pmol/反应，nT7引物浓度优选为
12.5pmol/反应,VC检测探针浓度优选为5pmol/反应’内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；(6) SAT酶液SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、I7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；(7) VC阳性对照；含IO5-IO8拷贝/mL霍乱弧菌(VC) toxR的体外转录RNA稀释物；⑶VC阴性对照不含有霍乱弧菌(VC)靶标核酸(VC RNA)序列或不含有霍乱弧菌的溶液，如生理盐水；(9) VC内标含IO5-IO8拷贝/mL VC内标RNA (序列7)，是VC核苷酸序列(VC RNA)的竞争性内标，为体外转录RNA(VC IC RNA)稀释物。以上所述试剂盒中各组成的进一步说明如下裂解液的主要有效成分是去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。捕获探针一端与靶标互补，一端与磁性颗粒互补连接，在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过洗涤液清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸(RNA)。细菌RNA的提取通过特异性吸附原理来实现。VC检测液中VC检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相t匕，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中设置了 VC阳性对照、VC阴性对照和VC内标。其中，IVA阳性对照和VC内标为体外转录的RNA，不具有生物学活性。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。VC内标作为VC RNA的竞争性内标，其最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。利用以上试剂盒对霍乱弧菌(VC)进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤(I)用裂解液裂解待测样品中的霍乱弧菌(VC)，得到含有霍乱弧菌(VC)核酸的裂解液； (2)向步骤I)的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在VC内标时，同时加入VC内标，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到霍乱弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ；(3)将步骤2)提取的霍乱弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA加入由VC反应液和VC检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3 I ；(4)根据荧光信号产生的时间和强度参照VC阳性对照、VC阴性对照和VC内标检测结果对待测样品进行定性检测。所述步骤4)中的VC阳性对照为含IO5-IO8拷贝/mL霍乱弧菌(VC)toxR的体外转录RNA稀释物；VC阴性对照为不含有霍乱弧菌(VC)靶标核酸(VC RNA)序列或不含有霍乱弧菌的溶液；VC内标为含IO5-IO8拷贝/mL VC内标RNA(序列7)稀释物。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，MX3005荧光定量仪为Stratagene公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。实施例I、用于实时荧光核酸恒温扩增检测霍乱弧菌(VC)的专用引物和探针的设计本发明选择VC细菌toxR中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根据引物探针设计原理，使用DNA ATAR,DNAman软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测霍乱弧菌(VC)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列(I) 一条可与如序列表中序列I所示的霍乱弧菌(VC)的靶标核酸(VC RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO,Target Capture Oligo),所述捕获探针的核苷酸序列为5’-GCCAGCUGGUAUCUUCGACUGACUUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(序列表中序列 2)；(2) 一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝的VC检测引物，所述VC检测引物由17引物和n!7弓丨物组成，17引物序列为5，-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATCACCTCGITTGGACGITGGGCCAGCA-3’ (序列表中序列 3)，n!7 引物序列为5’-TCCCCTAAGCAATACTCTGA3’ (序列表中序列 4)；(3) 一条用于与在I7RNA聚合酶作用下根据所述VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VC检测探针，所述VC检测探针的核苷酸序列为5’-CGCAUAGUGAAGAGAUCAUUCGAGUGCG-3’ (序列表中序列5)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光
(4)为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的竞争性VC内标(序列7)，设计了竞争性内标检测探针，VC内标与VC靶标核苷酸(VC RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述VC内标可通过VC靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与VC检测探针序列、突光标记不同，但碱基数一致的探针,所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’ -CGCUGGAGCGUGGUGAGCAGCG-3’ (序列表中序列6)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。实施例2、制备霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒利用实施例I所提供的专用引物和探针，得到本发明霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)、17引物、n!7引物、VC检测探针、内标检测探针、M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶。所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和VC检测探针、内标检测探针存在于VC检测液中，所述M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30°C储存的A盒(标本处理单元)和-15—-35°C储存的B盒(核酸扩增检测单元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括VC反应液、VC检测液、SAT酶液、VC阳性对照、VC阴性对照，如果存在内标，B盒还包括VC内标，主要成分如下A盒(标本处理单元)组成为裂解液；含硫酸铵((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕获探针1-50 uM(优选为5-25 u M)和磁珠50_500mg/L (优选为50-250mg/L)；洗涤液主要含Iwt % SDS。B盒(核酸扩增检测单元)组成为VC 反应液含 dNTP 0. I-IOmM (优选为 0. 5_5mM)，NTP l_20mM(优选为 I-IOmM)；VC检测液含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-15pmol/反应均可，其中17引物浓度优选为12. 5pmol/反应，n!7引物浓度优选为12. 5pmol/反应，VC检测探针浓度优选为5pmol/反应’内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；SAT 酶液含 M-MLV 反转录酶 400-4000U/ 反应(优选为 500-1500U/ 反应)，T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应);VC阳性对照；含IO5-IO8拷贝/mL霍乱弧菌(VC) toxR的体外转录RNA稀释物；VC阴性对照不含有霍乱弧菌(VC)靶标核酸(VC RNA)序列或不含有霍乱弧菌的溶液,如生理盐水；如果存在内标，VC内标含IO5-IO8拷贝/mL VC IC RNA稀释物(序列表中序列7)。试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下(I)裂解液为裂解和保存样本中的霍乱弧菌(VC)，含有硫酸铵和HEPES缓冲液的溶液，具体包含 HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液为提取霍乱弧菌(VC)RNA的含有oligo (dT)包被的磁珠和特异结合靶标核酸(VC RNA)的一段RNA序列的溶液，具体包含HEPES 50-400mM, EDTA40-200mM,LiCl 400-2000mM,捕获探针 1-50 y M(优选为 5_25u M)，磁珠 50_500mg/L(优选为50-250mg/L)；(3)洗涤液为含 SDS、NaCl 的溶液，具体包含 HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1%SDS 1-lOmM, EDTA I-IOmM ；(4)VC反应液为含dNTPs和NTPs扩增所需组份，具体包含Tris 10_50mM，MgCl210-40mM, dNTP 0. l-10mM(优选为 0. 5_5mM)，NT Pl_20mM(优选为 1-lOmM)，PVP401-10%, KCl 5-40mM ；(5) VC检测液将恒温扩增时必需的VC检测引物和VC检测探针溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探针浓度在5_15pmol/反应均可， 其中T7引物浓度优选为12. 5pmol/反应，nT7引物浓度优选为12. 5pmol/反应，VC检测探针浓度优选为5pmol/反应’内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；(6) SAT酶液为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、I7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2_10mM HEPES pH7.5、IO-IOOmM N-acetyl-L-cysteine>0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose,40-200mM Tris-HCl pH8. 0、40_200mM KCU0. 01-0. 5mM EDTA、
0.1-1 % (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；(7) VC阳性对照；含IO5-IO8拷贝/mL霍乱弧菌(VC) toxR的体外转录RNA稀释物；(8) VC阴性对照不含有霍乱弧菌(VC)靶标核酸(VC RNA)序列或不含有霍乱弧菌的溶液，如生理盐水；(9)如果存在内标，VC内标含IO5-IO8拷贝/mL VC内标RNA (序列表中序列7)。VC阳性对照中的体外转录的VC RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下I)用化学合成法合成VC toxR中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；2)将片段克隆到pGEM -T载体中，构建VC阳性对照质粒；3) VC阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5 a中，命名为pGEM -T-VC菌株，贮存于-70。。；4)从pGEM -T-VC菌株中提取pGEM -T-VC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。VC内标中的体外转录的VC IC RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下I)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同VC靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；2)将片段克隆到pGEM -T载体中，构建VC内标质粒；3) VC内标质粒转化到大肠杆菌DH5 a中，命名为pGEM _T_VC IC菌株，贮存于-70。。；4)从pGEM -T-VCIC菌株中提取pGEM -T-VC IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。实施例3、霍乱弧菌的实时荧光核酸恒温扩增检测灵敏度用本发明试剂盒(组成见实施例2，试剂盒内不存在VC内标和检测液中的内标检测探针)检测食品样本中的霍乱弧菌(VC)，具体方法包括以下步骤(I)菌液稀释测定浓度为I X 105CFU/mL的霍乱弧菌培养物，10倍梯度稀释到lOcFU/mL作为霍乱弧菌线性灵敏度参考品。(2)核酸提取2. I在样品处理管(I. 5mL离心管)中加入200 裂解液(含HEPES 35mM, (NH4) 2S0420mM)，200 ill菌液，用裂解液裂解待测样品中的霍乱弧菌(VC)，得到含有霍乱弧菌(VC)核酸的裂解液。2. 2在样品处理管(I. 5mL离心管)中加入100 U I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM,捕获探针10 u M，磁珠250mg/L)，混匀，60°C保温5分钟，室温放置10分钟。2. 3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入ImL洗涤液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振荡均匀后静置5_10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。2. 4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。(3) SAT核酸扩增检测3. I向样品处理管中加入40 U I反应检测液(40 U I VC反应液+2. 5 VC检测液)洗涤磁珠。VC 反应液具体包含 Tris 30mM,MgCl2 IOmM, dNTP lmm, NTP 2mM,PVP405%,KC125mM ；VC检测液中T7引物浓度为12. 5pmol, nT7引物浓度为12. 5pmol, VC检测探针浓度为5pmol。3. 2取振荡混匀的上述反应检测液30 U I加至洁净微量反应管，60°C保温10分钟，42°C保温5分钟；向微量反应管中加入10 u I已预热至42°C的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)进行实时荧光检测。SAT酶液中含M-MLV反转录酶 750U，T7RNA 聚合酶 500U/ 反应，IOmM HEPES pH7. 5，20mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酸-L-半胱氨酸)，0. ImM zinc acetate (乙酸锋)、IOmMtrehalose (海藻糖)、IOOmMTris-HCl pH8. 0,IOOmM KCl,0. Imm EDTA,0. 8 % (v/v)Triton X-100 和 40 % (v/v)glycerol (丙三醇)；3. 3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI仪器只可选VIC通道，但VIC与HEX波长相近)，42°C反应50分钟，设定每I分钟检测一次荧光，共检测50次。(4)结果判定根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)①阳性结果判定
VIC通道dt彡45的样本为阳性；45 < dt < 50的样本建议重新检测，检测结果dt < 50的样本为阳性。②阴性结果判定VIC通道dt无数值或为50，则为阴性。(5)结果图I显示灵敏度的检测图，将浓度为IX 105CFU/mL的阳性参考品，按10倍梯度稀释进行检测。当阳性参考品的浓度为100CFU/mL的时候，检测dt值为25，即检测下限灵敏度可以达到100CFU/mL。实施例4、霍乱弧菌的实时荧光核酸恒温扩增检测特异性本检测模式为本发明的另一个应用试剂盒组成同实施例2，试剂的生产在GMP车 间进行；特异性参考品处理的方法如下6例阴性参考品包括金黄色葡萄球菌(SA)、志贺氏 菌(SH)、大肠杆菌0157 (0157)、单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)、沙门氏菌(Sal. spp.)、副溶血弧菌(VP)，另设阴性对照、阳性对照各一个。检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3。使用本发明试剂盒的检测结果如图2，6个阴性参考品的扩增曲线平直且与基线无交叉，可明确判定为阴性。6例阴性参考品包括金黄色葡萄球菌(SA)、志贺氏菌(SH)、大肠杆菌0157(0157)、单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)、沙门氏菌(Sal. spp.)、副溶血弧菌(VP)。实施例5、实际食品样本的实时荧光核酸恒温扩增检测用本发明试剂盒(组成见实施例2，试剂盒含有VC内标，检测液内含有内标探针)检测食品样品中的霍乱弧菌VC，具体方法包括以下步骤(I)样本处理称取25g(mL)样品装入盛有225mL营养肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打Imin 2min。若样品为液态，不需要均质，震荡混匀。如为冷冻产品，应在45°C以下不超过15min，或2°C 5°C不超过18h解冻。霍乱弧菌样本编号为VC食品标本1_10，另设阴性对照、阳性对照各一个。(2)核酸提取2. I在样品处理管(I. 5mL离心管)中加入200iil裂解液(含HEPES 35mM,(NH4) 2S0420mM)，200 ill菌液，用裂解液裂解待测样品中的霍乱弧菌(VC)，得到含有霍乱弧菌(VC)核酸的裂解液。2. 2在样品处理管(I. 5mL离心管)中加入100 U I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 150mM, LiCl 1500mM,捕获探针 20 u M,磁珠 250mg/L), 10 U I 内标溶液(含 I X IO8 拷贝/mL VC内标RNA)，混匀，60°C保温5分钟，室温放置10分钟。2. 3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入ImL洗涤液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振荡均匀后静置5_10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。2. 4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。(3) SAT核酸扩增检测3. I向样品处理管中加入40 U I反应检测液(40 U I VC反应液+2. 5 VC检测液)洗涤磁珠。VC 反应液具体包含 Tris 50mM,MgCl2 2OmM，dNTP 5mM, NTP 10mM,PVP405%,KCl 40mM ;VC检测液中T7引物浓度为12. 5pmol，nT7引物浓度为12. 5pmol，VC检测探针浓度为5pmol,内标检测探针浓度为5pmol。3. 2取振荡混匀的上述反应检测液30 Ul加至洁净微量反应管，60°C保温10分钟，42°C保温5分钟；向微量反应管中加入IOiU已预热至42°C的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)进行实时荧光检测。SAT酶液中含 M-MLV 反转录酶 1500U，T7RNA 聚合酶 1000U/ 反应，IOmM HEPES pH7. 5，50mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酸-L-半胱氨酸)，0. 4mM zinc acetate (乙酸锋)、60mMtrehalose (海藻糖)、IOOmM Tris-HCl pH8. 0,200mM KC1,0. 3mM EDTA,0. 8% (v/v) TritonX-100 和 40% (v/v) glycerol (丙三醇)。3. 3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI公司产品，ABI仪器只可选VIC通道，但VIC与HEX波长相近)，42°C反应50分钟，设定每I分钟检测一次荧光，共检测50次。
(4)结果判定根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)③阳性结果判定Fl通道dt ( 45的样本为阳性；45 < dt < 50的样本建议重新检测，检测结果Fl通道dt < 50的样本为阳性。④阴性结果判定F1通道dt无数值或为50，同时F2通道dt ( 45，则为阴性。质量控制每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照Fl通道dt < 45 ;阴性对照Fl通道dt无数值或为50，同时F2通道dt < 45，否则此次检测结果视为无效。(5)结果根据Fl通道(图3)和F2通道(图4)的dt值情况，判定样本3、7检测为阳性，样本1、2、4、5、6、8、9、10为阴性(样本1、2、4、5、6、8、9、10图3显示为阴性，图4显示有信号，正说明内标可检测出，反应体系没有受环境影响，排除假阴性)。根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的霍乱弧菌(VC)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列I所示的霍乱弧菌(VC)的靶标核酸(VC RNA)的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝的VC检测引物17和nT7，和一条用于与在17RNA聚合酶作用下根据所述VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VC检测探针。
2.根据权利要求I所述试剂盒，其特征在于所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述VC检测引物由T7引物和n!7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述VC检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和17 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、n!7引物和VC检测探针存在于一 VC检测液中。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含有VC内标和内标检测探针；所述VC内标为VC核苷酸序列(VC RNA)的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和n!7引物)，由序列表中序列7所示的VC IC RNA ;所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于VC检测液中。
5.根据权利要求I至4任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、VC反应液、VC检测液、SAT酶液、VC阳性对照、VC阴性对照和VC内标，其中 裂解液含硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES ； 核酸提取液含捕获探针和磁珠； 洗涤液含NaCl和SDS ； VC反应液含dNTP和NTP ； VC检测液含17引物、n!7引物、VC检测探针和内标检测探针； SAT酶液含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶； VC阳性对照；含霍乱弧菌(VC) toxR的体外转录RNA稀释物； VC阴性对照不含有霍乱弧菌(VC)靶标核酸(VC RNA)序列或不含有霍乱弧菌的溶液，如生理盐水； VC内标VC IC RNA (序列如序列表中序列I所示)。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下(1)裂解液HEPES25-250mM,(NH4)2SO4 5_50mM ； (2)核酸提取液HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕获探针1-50 u M (优选为 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (优选为 50-250mg/L)；(3)洗涤液HEPES5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDS，EDTA I-IOmM ；(4)VC 反应液Tris 10_50mM，MgCl2 10_40mM，dNTP 0. I-IOmM(优选为 0. 5_5mM)，NTPl-20mM(优选为 I-IOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ； (5)VC检测液将VC检测引物和VC检测探针溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImMEDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-15pmol/反应均可；其中17引物浓度优选为.12. 5pmol/反应，nT7引物浓度优选为12. 5pmol/反应，VC检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应； (6)SAT酶液M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA 聚合酶 200-2000U/ 反应(优选为 500-1000U/ 反应)、2_10mM HEPES pH7. 5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine^0. 04-0. 4mM zinc acetate^IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5mM EDTA、0. 1-1% (v/v) Triton X-100和 20-50% (v/v) glycerol ； (7)VC阳性对照；含IO5-IO8拷贝/mL霍乱弧菌(VC) toxR的体外转录RNA稀释物； (8)VC阴性对照不含有霍乱弧菌(VC)靶标核酸(VC RNA)序列或不含有霍乱弧菌的溶液； (9)VC内标含IO5-IO8拷贝/mL VCIC RNA(序列如序列表中序列7所示)体外转录RNA稀释物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述VC反应液、VC检测液、SAT酶液、VC阳性对照、VC阴性对照及VC内标。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于所述VC阳性对照中的体外转录的VC RNA以下述方法制备 (1)用化学合成法合成VCtoxR中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)； (2)将片段克隆到pGEW-T载体中，构建VC阳性对照质粒； (3)VC阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5 a中，命名SpGEMs -T-VC菌株，贮存于_70°C ； (4)纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA； 存在VC内标时，体外转录的VC IC RNA以下述方法制备 (1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同VC靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)； (2)将片段克隆到pGEM -T载体中，构建VC内标质粒； (3)VC内标质粒转化到大肠杆菌DH5 a中，命名为pGEM -T-VC IC菌株，贮存于-70°C; (4)纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。
9.权利要求1-8任一所述霍乱弧菌(VC)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一 (1)可与序列表中序列I所示的霍乱弧菌(VC)的靶标核酸(VCRNA)序列特异结合的捕获探针(TCO,Target Capture Oligo),所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示； (2)用于在M-MLV反转录酶作用下产生VC靶标核酸(VCRNA)的DNA拷贝的VC检测引物17和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示； (3)用于与在17RNA聚合酶作用下根据所述VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VC检测探针，所述VC检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；(4)内标和内标检测探针，内标为VC核苷酸序列(VC RNA)的竞争性内标，可与(I)所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和n!7引物)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示,5’端标记HEX突光基团,3’端标记DABCYL淬灭基团。
10.一种权利要求1-8任一所述的试剂盒的使用方法，用于霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作 (1)用裂解液裂解待测样品中的霍乱弧菌(VC)，得到含有霍乱弧菌(VC)核酸的裂解液； (2)向步骤I)的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在VC内标时，同时加入VC内标，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到霍乱弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ； (3)将步骤2)提取的霍乱弧菌(VC)的核酸(RNA)和VCIC RNA加入由VC反应液和VC检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3 I ； (4)根据荧光信号产生的时间和强度参照VC阳性对照、VC阴性对照和VC内标检测结果对待测样品进行定性检测。
全文摘要
本发明公开了一种霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括捕获探针、VC检测引物T7引物和nT7引物、VC检测探针、M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明试剂盒能够检测食品中的VC RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达100 CFU/ml)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(常规50分钟完成检测)的特点，将在霍乱弧菌快速检测中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/11GK102719542SQ20121020330
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者于明辉, 居金良, 张长明, 李豪 申请人:上海仁度生物科技有限公司