专利名称：定量检测大肠杆菌rna的方法及其专用标准品和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。
背景技术：
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种食源性致病菌,会引起腹湾、恶心、出血性结肠炎等症状。近年来，由大肠杆菌引发的感染性疾病在许多国家都相继报道，已经成为世界性的环境安全性问题。目前，大肠杆菌的传统检测方法是培养法。然而，近年的研究发现，细菌在环境压力(如高温)下可以进入“具有活性但不可培养(viable but nonculturable, VBNC)”的状态，无法用常规培养法检出，但仍然保持代谢活性和致病性，能够在环境压力解除的条件下恢复其可培养性，引发严重的微生物安全风险。已经有研究表明，大多数革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌)也可以进入这样的状态。因此，传统培养法无法检测到处于VBNC状态的大肠杆菌而得到假阴性的结果。PCR技术可以快速、灵敏的检测到目标菌。然而有研究表明，经过热处理后，尽管细菌已经丧失细胞活性，但作为PCR扩增模板的DNA仍可以存在数天，因此常规PCR技术无法区分活性菌与非活性菌。与DNA相比，大多数mRNA较不稳定，其半衰期较短(仅几分钟)，可以更好的作为活性菌存在的分子信标。已有大量研究证实，细菌体内mRNA的存在与其细胞活性之间存在显著关系。又有研究表明，处于VBNC状态的细菌仍具有转录活性，其体内仍可以检测到一定量的mRNA。实时荧光定量PCR和反转录(又称逆转录)为定量检测样品中的RNA提供了技术手段。有研究者使用基因组DNA或者质粒DNA片段作为反转录实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测实际样品中RNA的标准品。可是，使用DNA作为标准品并没有考虑到反转录中的效率问题，从而导致检测到的RNA与实际相比减少了 84%-98. 6%。因此，以DNA作为检测RNA的标准品会大大低估样品中实际的RNA的含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。本发明提供了一种定量检测大肠杆菌RNA的方法，包括如下步骤(I)按照如下方法制作标准曲线；将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液，然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数(也可对拷贝数进行数据处理，如拷贝数以10为底的对数)和Ct值制作标准曲线方程；(2)提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCRJf Ct值代入所述标准曲线方程，得到大肠杆菌的RNA含量。所述RNA标准品可为所述大肠杆菌的部分核酸片段。
所述步骤(I)的所述实时荧光PCR和所述步骤(2)中的所述实时荧光PCR的反应体系和反应条件均可相同。所述RNA标准品具体可为序列表的序列6所示的单链RNA分子。
所述实时荧光PCR采用的引物对具体可为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。所述标准曲线具体为一元线性回归曲线。所述实时荧光定量PCR的退火温度具体可为55. 5° C。以上任意所述方法均可应用于检测大肠杆菌活菌数(一个拷贝数的RNA可以代表一个活菌)。所述检测大肠杆菌活菌数具体可为检测水样中的大肠杆菌活菌数。本发明还保护序列表的序列6所示的单链RNA分子。本发明还保护序列表的序列I所示的双链DNA分子。本发明还保护定量检测大肠杆菌RNA的特异引物对，由序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成。本发明还保护一种定量检测大肠杆菌RNA (或检测大肠杆菌活菌数)的试剂盒，包括标准品和特异引物对；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。本发明还保护标准品和/或特异引物对在制备定量检测大肠杆菌RNA的试剂盒(或制备检测大肠杆菌活菌数的试剂盒)中的应用；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。本发明还保护序列表的序列6所示的单链RNA分子和/或特异引物对在检测大肠杆菌活菌数中的应用；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。由于细菌的RNA较不稳定，半衰期短，因此可以作为活性菌的分子信标。本发明提供的方法中，将RNA用作定量RNA拷贝数的标准品(标准品和待测RNA —样进行了反转录，从而扣除了反转录效率的影响)，可以更准确的定量大肠杆菌RNA，从而更准确的检测待测样本中的大肠杆菌数量。本发明采用的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于环境样品中大肠杆菌的快速定量检测。定量PCR具有快速、灵敏的优点。因此，本发明的方法可用于快速检测环境中少量的大肠杆菌，为快速检测活性大肠杆菌提供技术支持。
图I为采用各个退火温度得到的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图2为采用引物对乙进行特异性验证中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图3为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的PCR扩增曲线图。图4为标准曲线图。图5为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的溶解曲线图。
图6为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的琼脂糖凝胶电泳图。图7为实施例5中的溶解曲线图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli),又称大肠杆菌中国普通微生物菌种保存管理中心(网址为 http://www. cgmcc. net/), CGMCC 编号为 I. 2385。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium):美国模式培养物集存库(ATCC,网址为 www. atcc. org/), ATCC 编号为 14028。 耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis):中国普通微生物菌种保存管理中心(网址为 http://www. cgmcc. net/), CGMCC 编号为 CGMCC I. 562。实施例I、引物的合成与标准品的制备一、引物的设计与合成对大肠杆菌的基因组DNA进行分析，选取UidA基因的部分序列，根据该序列设计两对引物(引物对甲和引物对乙)。引物对甲由uidA-T7_F和uidA-T7_R组成，靶序列为序列表的序列I所示的双链DNA 分子，为 92 Ibp。uidA-T7-F (序列 2) :5，_taatacgactcactataggggcgttacaagaaagcc_3，；uidA-T7-R (序列 3) :5_gcatctcttcagcgtaagggtaatgcga_3，。引物对乙由UidA-F和UidA-R组成，靶序列为序列表的序列I自5’末端第257至443位核苷酸所示的双链DNA分子，为187bp。uidA-F (序列 4) :5，_cgatgtcacgccgtatgttatt_3，；uidA-R (序列 5) :5，-ggtgtagagcattacgctgcg-3，。分别合成以上各条引物。二、标准品的制备I、提取大肠杆菌的基因组DNA。2、以步骤I提取的基因组DNA为模板，采用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。3、将步骤2的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，利用TaKaRa切胶回收试剂盒(TaKaRa Code DV805A)回收约 921bp 的 DNA 片段。4、采用promega体外转录试剂盒(promega Code P1320)将步骤3回收的DNA片段进行体外转录，获得与所述DNA片段对应的RNA片段(标准品)。二、标准品的测序I、将步骤二获得的标准品进行反转录，获得与其对应的cDNA。2、采用天根DNA纯化回收试剂盒(Code DP214)回收纯化步骤I得到的cDNA。3、将步骤2得到的cDNA进行测序，测序结果如序列表的序列I所示(序列I中，自5’末端第I至20位核苷酸为T7启动子)。测序结果表明，步骤二得到的标准品为序列表的序列6所示的单链RNA。实施例2、标准品的梯度稀释检测RNA拷贝数的方法利用超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop ND-2000C，美国)测定RNA浓度，然后按照如下公式计算RNA拷贝数
权利要求
1.一种定量检测大肠杆菌RNA的方法，包括如下步骤 (1)按照如下方法制作标准曲线^fRNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液，然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数和Ct值制作标准曲线方程； (2)提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，将Ct值代入所述标准曲线方程，得到大肠杆菌的RNA含量。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述RNA标准品为所述大肠杆菌的部分核酸片段；所述步骤(I)的所述实时荧光PCR和所述步骤(2)中的所述实时荧光PCR的反应体系和反应条件相同。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述RNA标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述实时荧光PCR采用的引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。
5.权利要求I所述方法在检测大肠杆菌活菌数中的应用。
6.序列表的序列6所示的单链RNA分子或序列表的序列I所示的双链DNA分子。
7.定量检测大肠杆菌RNA的特异引物对，由序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成。
8.一种试剂盒，包括标准品和特异引物对；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所不DNA片段和序列表的序列5所不DNA片段组成的引物对；所述试剂盒的功能为定量检测大肠杆菌RNA或检测大肠杆菌活菌数。
9.标准品和/或特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对；所述试剂盒的功能为定量检测大肠杆菌RNA或检测大肠杆菌活菌数。
10.序列表的序列6所示的单链RNA分子和/或权利要求7所述特异引物对在检测大肠杆菌活菌数中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。本发明提供的方法包括如下步骤(1)按照如下方法制作标准曲线；将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液，然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数(也可对拷贝数进行数据处理，如拷贝数以10为底的对数)和Ct值制作标准曲线方程；(2)提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，将Ct值代入所述标准曲线方程，得到大肠杆菌的RNA含量。本发明的方法可用于快速检测环境中少量的大肠杆菌，为快速检测活性大肠杆菌提供技术支持。
文档编号C12Q1/06GK102936619SQ20121020218
公开日2013年2月20日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者何苗, 林怡雯, 李丹, 吴舒旭 申请人:清华大学