专利名称：一种猪流感病毒毒株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物病毒领域，涉及病毒新毒种，具体涉及ー种猪流感病毒毒株及其生物学特性。
背景技术：
2010年10月，漯河市某猪场猪群7头I月龄猪只先后发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为流鼻涕，发烧和咳嗽。采集发病猪的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培养液中，置于冰盒中并在24h内送至实验室。鼻拭子进行漩涡震荡高速离心处理，取上清接种10日龄鸡胚尿囊腔接种。结果分离到ー株有血凝性的疑似流感病毒，经分子鉴定后确定其为H1N2猪流感病毒。
发明内容
本发明本发明的目的是提供ー种猪流感病毒毒株，分类命名猪流感病毒，拉丁文学名swine influenza virus,简称SIV,保藏单位中国典型培养物保藏中心,保藏单位简称CCTCC，保藏单位地址武汉市武汉大学，保藏日期2012年5月15日，保藏编号CCTCCNO V201223o本发明的技术方案是ー种猪流感病毒毒株，猪流感病毒(swine influenzavirus), CCTCC NO :V201223。所述的猪流感病毒毒株具有下述特点
(1)所述毒株的核酸类型是单股负链RNA病毒，由大小不等的8个独立节段组成，分别是PB2 基因片段长度为 2341 bp，PBl 为 2341 bp，PA 为 2233 bp，HA 为 1777 bp，NP 为 1565bp, NA 为 1466 bp, M 为 1027 bp, NS 为 890 bp。
(2)所述毒株对脂溶剂こ醚、氯仿和酸敏感；属于热稳定型毒株；血凝谱较广，能凝集鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊和牛的红细胞。(3)对鸡胚的致病カ较弱，其中EID5tl为10_5 86 ,ELD50为10_2 43 ;能够感染MDCK细胞，造成细胞拉网脱落等病变；小鼠感染试验中未观察到明显临床症状，感染后14天能从小鼠血液中检测到抗体。(4)利用通用引物对所述毒株进行PCR鉴定后，再进行全基因组PCR扩增并克隆测序，用philip3. 64分析软件结果显示该毒株为新型四源重组病毒，其中HA、NP和NS片段来源于经典猪流感；NA和PBl片段来源于类人H3N2流感病毒；PB2推测来源于美洲禽流感；M基因来源于欧洲禽流感。所述的猪流感病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。本发明的有益效果是本发明的H1N2猪流感病毒灭活后免疫猪只，可以给猪提供有效的的保护，可应用在制备疫苗的生产毒种。
图I为SIV通用引物电泳 图2为亚型引物PCR产物电泳图；M :DNA质量分子标准；1-3 :SIV通用引物RT-PCR阳性样品；P :阳性对照；N :阴性对照
图3为SIV全基因组PCR产物电泳图；Mark :DNA质量分子标准；1_8 :PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因片段。
具体实施例方式2010年10月，漯河市某猪场7头I月龄猪只发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为流鼻涕，发烧和咳嗽，其发病表现与国内报道的其他地区发病的猪流感症状大致相似，初歩判断为猪流感。
采集发病猪的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培养液中，置于冰盒中并在24 h内送至实验室。鼻拭子进行漩涡震荡高速离心处理，取上清接种10日龄鸡胚尿囊腔接种。结果分离到ー株有血凝性的疑似流感病毒，血凝试验排除鸡新城疫和禽减蛋综合征病毒。第3代尿囊液进行有限稀释克隆后其最高血凝价71og2 ;用特异性引物进行分子鉴定后确定其为H1N2猪流感病毒。理化特性试验表明所述毒株经过氯仿、こ醚和酸处理后，不能再感染鸡胚，判断其对脂溶剂敏感。病毒属于热稳定型毒株；血凝谱较广，能凝集鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊和牛的红细胞。该病毒对鸡胚的致病カ较弱，其中EID5tl为10_5 86 ,ELD50为10_2 43 ;能够感染MDCK细胞，造成细胞拉网脱落等病变；小鼠未观察到明显临床症状，感染后14天能从小鼠血液中检测到抗体。对所述毒株进行全基因组PCR扩增并克隆测序，用philip3. 64分析软件结果显示该毒株为新型四源重组病毒，其中HA、NP和NS片段来源于经典猪流感；NA和PBl片段来源于类人H3N2流感病毒；PB2推测来源于美洲禽流感；M基因来源于欧洲禽流感。本发明中，毒株定名为A/swine/Henan/YIL/2010 (H1N2)株，简称 SWHN/HL/10 株。I、流行病学调查2010年10月，漯河市某猪场7头I月龄猪只先后发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为高烧，流鼻涕，咳嗽，呼吸困难，并且具有传染性，其发病表现与国内外报道的其他地区发病的猪流感症状大致相似，初歩判断为猪流感。采集患病猪的鼻拭子和病死猪的肺脏样品，将样品立即保存于含抗生素的DMEM培养液中，置于冰盒中并在24 h内送至实验室。2、病毒分尚将鼻拭子样品润旋震荡处理15秒,挤出液体,4 °C 5000 r/min尚心4 min，取上清，4°C作用过夜。采集病死猪的肺组织在无菌条件下剪碎并研磨，用PBS液(含链霉素和青霉素终浓度为3000 u g /mL，3000 IU/ mL)制成10%的匀浆，4で作用5 h，反复冻融3次，按上述条件离心，取上清。将上清经尿囊腔接种扩10日龄非免疫鸡胚，0.2 mL/枚，每个样品接种2枚，35 °C条件下孵育96 h,并保持一定的湿度，每隔8 h照胚，弃去24h内死亡鸡胚。收集24 96 h死亡和未死亡鸡胚置4で冷却过夜，次日无菌收集尿囊液。结果表明无菌检验合格的病料接种鸡胚后，96 h内无鸡胚死亡发生，对照组鸡胚也全部健活。经过3代鸡胚盲传以后，发现所收获尿囊液具有血凝性，并且均与抗ND和EDS-76阳性血清HI试验为阴性，第3代尿囊液进行具有血凝活性的尿囊液接种的鸡胚均表现出不同程度的全身出血变化，死亡胚与存活胚病变显著，胚胎发育阻滞，胚体头颈部、背部、大腿、翅膀及腹部出血明显，严重者呈弥漫性出血。第3代尿囊液进行有限稀释克隆后其最高血凝价71og2。3、病毒PCR鉴定通用引物是根据GenBank数据库中已有的猪流感病毒的NP基因核苷酸序列用Clustal、DNAstar等生物软件进行同源性分析后，选出较为保守的核苷酸区域，应用Primer 5. 0设计特异性引物根据NP基因设计合成，亚型引物參照Choi等设计的亚型引物合成。參照Invitrogen Trizol LS Reagent的说明进行,具体操作步骤如下取新鲜的病毒样品250 U L加入装有750 V- L Trizol的I. 5 mL RNase-free离心管中混合均勻，室温静置5min ;加入200 U L氯仿，涡旋混匀15 S，室温静置5 min ；4°C 12, 000 g/min离心15min,转移上相至新管中，加入等体积异丙醇(约500 ii L),轻缓混勻，室温放置15 min, 4 V12，000g/min离心10 min,弃上清,RNA在管侧和管底形成胶状沉淀；加入I mL RNase-free 75%こ醇，温和颠倒混匀，4 V 7，500g/min离心5 min，弃上清，将离心管置于超净台风干，加入20 UL DEPC处理过的双蒸水溶解，最后分装成小管，可置-70で保存备用。RT反应体系按Takara公司反转录试剂盒说明书进行。各成分加入后混匀离心，42で保温I h，70で保温15 min后冰上冷却备用。PCR反应体系
权利要求
1.一种猪流感病毒毒株，其特征在于猪流感病毒(swine influenza virus), CCTCCNO V201223o
2.如权利要求I所述的猪流感病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。
全文摘要
发明公开了一种猪流感病毒毒株，猪流感病毒(swineinfluenzavirus)，CCTCC NOV201223。本发明的猪流感病毒灭活后免疫猪只，可以给猪提供有效的保护，可应用在制备疫苗的生产毒种。
文档编号C12R1/93GK102766604SQ20121020282
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者宁长申, 岳耀辉, 张云, 张龙现, 胡慧, 菅复春 申请人:河南农业大学