专利名称：以粒毛盘菌胞外多糖作为制备预防胃溃疡药的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于粒毛盘菌胞外多糖在制药领域中的应用技术领域，具体涉及菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌所产胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用方法。
背景技术：
胃溃疡是一种常见的消化系统疾病，因其发病率越来越高，临床症状不明显，潜在危害性较大，因此越来越受到人们的关注。胃溃疡发病机制各异，如幽门结扎型胃溃疡是胃酸和胃蛋白酶分泌失调引起的慢性胃溃疡，而无水乙醇型胃溃疡则是由于乙醇直接损伤 胃黏膜引起的急性胃溃疡。目前临床上通常使用的治疗药物主要有碱性抗酸药、受体阻断剂、质子泵抑制剂、胃黏膜保护剂和抗生素等，但上述现有药物因疗程较长，且服药后易出现不适感和有不同程度的毒副作用，使很多患者无法接受长期治疗。因此，挖掘与开发天然的、无毒副作用且可以长期服用的预防胃溃疡药物对维护人类健康具有重要的意义。多糖是一类天然高分子化合物，通常几乎无毒。粒毛盘菌属(Lachnum Retz.)是分布广泛的一类腐生性真菌，在液体培养条件下能产生多种生物活性物质，如多糖、多酚、色素等。中国《药物研究》(2011年第20卷第I期第14-15页)公开了枸杞多糖对大鼠实验性胃溃疡的作用研究，实验结果表明枸杞多糖具有抗实验性胃溃疡的功能，但文献中涉及的枸杞多糖为植物源多糖，并未提到微生物源多糖的预防胃溃疡功能；中国专利号ZL201010582408. 6公开了一种粒毛盘菌多糖在制备抗疲劳药物中的应用。中国专利申请号201110184104. 9中首次公开了菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌及其胞外多糖在降脂利肝药物中的用途。但至今未见有公开文献提及以粒毛盘菌胞外多糖作为制备预防胃溃疡药的应用方面的报道。
发明内容
本发明提供一种以菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌所产胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用方法，以满足人们对预防胃溃疡药物的需要。本发明以菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌所产胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用方法，其特征在于将菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌接种于4L发酵罐，培养基配方为葡萄糖37-47g/L，酵母膏10_17g/L，甘氨酸 6-7mg/L，MgSO4 · 7H20 O. 8-1. lg/L，KH2PO4 O. 9-1. IgL，装料系数体积比为 O. 6-0. 8，接种量按体积比为13-16%，培养温度为23-37 °C，通气量为O. 9-1. lL/min，搅拌转速为170-190r/min，发酵时间为9_11天；将发酵液抽滤、浓缩后，加入其2_4倍体积的质量分数为90% -100%的乙醇于4°C醇沉18-25h，将醇析液以4000_5000r/min离心8_10min，去上清，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤2 3次，然后用蒸馏水溶解，采用赛沃杰法(Sevag法)脱蛋白，在体积百分浓度为30%的H2O2中50-55°C保温进行脱色处理后，蒸馏水常温透析20-30小时，_48'50°C冷冻干燥，得到粒毛盘菌胞外多糖粉末；将上述粒毛盘菌胞外多糖粉末用质量百分浓度为O. 9%的生理盐水配置成剂量为100-400mg/mL的水溶液,给药体积为9_llmL/kg,灌胃小鼠2_3周,最后一次给药I小时后用无水乙醇灌胃，剂量为每200g体重给予O. 9-1. ImL无水乙醇，I小时后,摘眼球取血,将小鼠脱颈椎处死，取胃，观察并测定溃疡面积，计算胃溃疡指数，测定小鼠的胃蛋白酶活性、胃液量及胃液总酸度及小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；实验结果证实，上述粒毛盘菌胞外多糖不仅能有效预防小鼠胃溃疡，且无毒副作用。本发明以粒毛盘菌胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用方法，其特征在于可配制成如下剂型使用
A、加工成片剂取上述制备的300_600g的粒毛盘菌胞外多糖，与药用辅料稀释剂200-250g和助流剂30-60g混匀后，再与250_600mL乙醇混合均匀制得软材，将该软材过筛得到的湿颗粒干燥后整粒，最后加入润滑剂3-10g混匀后压片，制成片剂1000片；所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌；或B、加工成胶囊剂取药用辅料稀释剂200-270g、助流剂40_70g和润湿剂3_6g混匀后，与300-600g的粒毛盘菌胞外多糖混合均匀后分装入1000粒1#空心胶囊内，制得胶囊剂1000粒；所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。本发明使用菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌所产胞外多糖为原料作为制备预防胃溃疡药物的应用，所制备的药物克服了现有碱性抗酸药、受体阻断剂、质子泵抑制剂、胃黏膜保护剂以及抗生素等药物疗程较长且具有不同程度的毒副作用等缺点。经本发明的实验研究证实，上述粒毛盘菌胞外多糖不仅能有效预防小鼠胃溃疡，且无毒副作用，其制备方法简单经济，故可将上述粒毛盘菌胞外多糖应用于制备片剂或胶囊剂型预防胃溃疡的药物。
图I是经不同处理后的小鼠胃的照片比较，其中A为正常组、B为阴性对照组、C为多糖低剂量组、D为多糖中剂量组、E为多糖高剂量组、F为阳性对照组的小鼠胃的照片。
具体实施例方式实施例I :一、粒毛盘菌胞外多糖的制备将菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌接种于4L发酵罐，培养基配方为葡萄糖 40g/L，酵母膏 12g/L，甘氨酸 6. 2mg/L, MgSO4 · 7H20 lg/L, KH2PO4 IgL，装料系数为O. 7，接种量为15% (体积比)，培养温度为35°C，通气量为I. OL/min，搅拌转速为180r/min，发酵时间为10天；将发酵液抽滤、浓缩后，加入其3倍体积的质量分数为95%的乙醇于4°C醇沉24h，将醇析液以5000r/min离心lOmin，去上清，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤2 3次，然后用蒸馏水溶解，Sevag法脱蛋白及30%的H2O2保温(50°C )脱色处理后，蒸馏水常温透析24h，-50°C冷冻干燥，即得菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌所产胞外多糖。二、粒毛盘菌胞外多糖生理盐水溶液的制备将上述粒毛盘菌胞外多糖粉末用O. 9%生理盐水分别配置成100mg/mL、200mg/mL和400mg/mL的水溶液,采取的给药体积为10mL/kg。三、粒毛盘菌胞外多糖对小鼠预防胃溃疡的作用药理实验(I)动物昆明小鼠60只，雌雄各半，体重22 ± 2g，随机分组。(2)试剂盒超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)，为南京建成生物工程研究所生产的产品；阳性药物硫糖铝片，为上海延安万象药业有限公司生产的产品。(3)方法小鼠于实验环境下适应一周后随机分成6组，每组10只，分别为正常对照组、阴性对照组(百分浓度O. 9%的生理盐水)、多糖低剂量组(100mg/kg)、多糖中剂量组(200mg/kg)、多糖高剂量组(400mg/kg)、阳性对照组(硫糖招片150mg/kg)。每天上午10 00时分别对各组小鼠进行相应的灌胃处理，按照小鼠体重给予不同体积的受试物，自由摄食和饮水，连续给药14天，最后一次给药前小鼠禁食24小时，禁食期间饮水不限，最后一次给药I小时后用无水乙醇灌胃，剂量为每200g体重给予ImL无水乙醇，I小时后,摘眼球取血，将小鼠脱颈椎处死。
(4)相关指标测定小鼠胃液分泌量、胃酸浓度和胃蛋白酶活性的测定将小鼠剖腹取胃，收集胃液，然后将收集的胃液移至刻度离心管中，记录胃液总量。以4000r/min离心5min,取上清胃液O. ImL,加酹红指示剂I滴,用O. 001mol/L NaOH滴定，直至胃液先呈黄色后转为红色2秒钟内不消失为终点，计算耗去的NaOH量即总酸度。取上清胃液，按照试剂盒说明测定胃蛋白酶活性。胃溃疡抑制率的测定从小鼠幽门处注入3mL百分浓度为4%的甲醛溶液，将胃浸入甲醛溶液中固定30min后，沿胃大弯切开，用干燥的棉球轻轻擦去胃内容物，肉眼观察小鼠胃粘膜，测量胃黏膜溃疡长度及宽度(不足Imm的溃疡点按Imm计)，计算溃疡面积；考虑到各组小鼠胃面积大小不同，以溃疡指数衡量多糖对小鼠胃溃疡的抑制作用。其中胃溃瘍指数=胃溃瘍面积/胃面积X 100% ；溃疡抑制率=(模型对照组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型对照组溃疡指数 X 100%O小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的测定8000r/min离心5min,分离血清,严格按照试剂盒的说明，测定小鼠血清中MDA及SOD的含量。(5)实验结果灌胃粒毛盘菌胞外多糖2周后，得到各处理组小鼠胃粘膜照片如图I中所示。其中A为正常组、B为阴性对照组、C为多糖低剂量组、D为多糖中剂量组、E为多糖高剂量组、F为阳性对照组的小鼠胃的照片。从图I照片中可见正常组小鼠胃粘膜呈乳红色，胃完整清晰；阴性对照组小鼠胃粘膜呈红色，腺胃部红肿、充血，并有片状出血及粘膜糜烂；多糖组小鼠胃黏膜红肿、充血程度明显减轻，可见点状和少量条索状出血；阳性对照组小鼠胃粘膜状况与正常组小鼠相差不大。表I给出了粒毛盘菌胞外多糖对各组小鼠相关指标的影响表I粒毛盘菌胞外多糖对各组小鼠相关指标的影响
组别胃溃，指数胃蛋=活性■量(ml)胃液总^ SOD (U/ml) . M°f· n (%)(U)(m mol/L)(n mol/ml)
正常组20.14±1.34 0.29±0.011 7.11±0.197 108.11±2.79 16.18±1.07· 丨巧:秀!寸 46.3±2.62d33.08±2.21d0.56±0.013d9.16±0.04791.49士 3.69d26.75±1.54d
照组
多氏 27.1±1.74bd30.62士 2.50d0.45 士0.039ad9.07 士0.084c101.59±6.9121.31±0.92bd
剂量组
/ 10'53iL2125.08士 1.44bc0.34±0.038b6.49±0.244bd113.95±3.45b17.84 士 0.56b
剂量组
4.43±0.47m 20.30±0.94b0.25±0.014bd3.47±0.181bd128-52±3·0013.57士 0.49bd
剂量组
its 0.88±0.08b21.26士 1.01b0.32 士 0.017b8.39 士0.397106.80±4.07b16.82±0.75b
JiRai_注表I中，ap〈0. 05，与模型对照组相比；bp〈0. 01，与模型对照组相比；ep〈0. 05，与阳性对照组相比；dp〈0. 01，与阳性对照组相比。对表I中的各组指标参数进行比较分析，可以看出粒毛盘菌胞外多糖对各处理组小鼠相关指标的影响。与阴性对照组相比，各剂量多糖均显著降低了小鼠的胃溃疡指数，显示不同程度的溃疡抑制率。相比于正常组，模型对照组小鼠胃蛋白酶活性、胃液量及胃液总酸度均明显升高，灌胃粒毛盘菌胞外多糖2周后，低、中、高剂量多糖均使其显著降低，且呈一定的量效关系。表明此多糖可显著抑制小鼠胃蛋白酶活性及胃液分泌，降低胃液总酸度，从而降低小鼠的胃溃疡指数，抑制胃溃疡的发生。与阴性对照组小鼠相比，各剂量多糖组小鼠血清中SOD活性均显著提高，MDA含量显著降低，其中高剂量多糖组小鼠血清中SOD活性提高了 40. 47%,MDA含量降低了 49. 27%，两者均具有极显著差异(P〈0. 01)。以上结果表明粒毛盘菌胞外多糖可明显提高小鼠血清中SOD活性，降低MDA含量，显示其预防胃溃疡功能。上述药理学实验分析测定了小鼠胃溃疡病症最具代表性的指标，从以上结果可以看出，在给药剂量为100-400mg/(kg bw)时，菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌产胞外多糖具有显著的预防胃溃疡作用，可显著抑制溃疡小鼠的胃溃疡指数，提高溃疡抑制率，降低胃蛋白酶活性、胃液量及胃液总酸度，提高血清中SOD活性，降低MDA含量，表现出明显的预防胃溃疡功能。实施例2 先按如下条件和方式制备获得粒毛盘菌胞外多糖将菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌接种于4L发酵罐，培养基配方为葡萄糖 46gL，酵母膏 14g/L，MgSO4 · 7H20 I. lg/L, KH2PO4 I. IgL，装料系数为 O. 8，接种量为15%，培养温度为25°C，通气量为I. OL/min，搅拌转速为190r/min，发酵时间为9天；将发酵液抽滤、浓缩后，加入其3倍体积的质量分数为95%的乙醇于4°C醇沉18h，将醇析液以5000r/min离心IOmin,去上清,沉淀用无水乙醇、丙酮洗漆2^3次,然后用蒸懼水溶解，Sevag法脱蛋白及30%的H2O2保温(55°C )脱色处理后，蒸馏水常温透析28h，_48°C冷冻干燥，即得菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌产胞外多糖。然后将上述粒毛盘菌胞外多糖粉末用O. 9%生理盐水配置成100mg/mL、200mg/mL、400mg/mL的水溶液，给药体积为10mL/kg。将上述各剂量的粒毛盘菌胞外多糖进行小鼠预防胃溃疡的作用药理实验，所采用的方式步骤和其他条件均与实施例I中相同，也都得到了与实施例I中类似的结果。将本实验室保存的在申请中国专利申请号201110184104. 9中所制备的菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌胞外多糖样品按照实施例I的方式步骤和条件进行了实验，也都得到了与实施例I中基本相同的结果。 上述实施例的实验说明，菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌的胞外多糖不仅能有效预防小鼠胃溃疡，且无毒副作用，其制备方法简单经济，故可将菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌产的胞外多糖应用于制备片剂或胶囊剂型预防胃溃疡的药物。实施例3 :粒毛盘菌胞外多糖制剂的加工本发明以菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌产胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用，具体可配制加工成如下剂型的方式进行使用I、片剂加工将300_600g的粒毛盘菌胞外多糖与药用辅料稀释剂200_250g、助流剂30_60g混匀后250-600mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂3-10g混匀后压片，制成1000片片剂。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌。本发明推荐的片剂加工的优选例为取过8(Γ100目筛的上述粒毛盘菌胞外多糖500g、稀释剂糊精240g、助流剂滑石粉50g，混合均匀后加400mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂硬脂酸镁IOg混匀后压片，制成1000片，片重O. 8g，多糖含量O. 5g/片。2、胶囊剂加工将药用辅料稀释剂200-270g、助流剂40_70g、润湿剂3_6g混匀后与300_600g的粒毛盘菌YM-281胞外多糖混合均匀后装1#空心胶囊，制得胶囊剂1000粒。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润湿剂
采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。本发明推荐的胶囊剂加工优选例为取稀释剂干淀粉250g，助流剂滑石粉45g，润湿剂十二烧基硫酸钠5g混合均勻与500g上述粒毛盘菌胞外多糖混合均勻后装1#空心胶囊1000粒，多糖含量O. 5g/粒。本发明使用菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌所产胞外多糖为原料作为制备预防胃溃疡药物的应用，所制备的药物可以克服现有碱性抗酸药、受体阻断剂、质子泵抑制剂、胃黏膜保护剂以及抗生素等药物疗程较长且具有不同程度的毒副作用等缺点，且制备方法简单经济。
权利要求
1.以菌种保藏编号为CCTCCNo:M 2011196的粒毛盘菌产胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用。
2.如权利要求I所述以菌种保藏编号为CCTCCNo:M 2011196的粒毛盘菌产胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用，特征在于所述粒毛盘菌产胞外多糖，是将菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌接种于4L发酵罐，培养基配方为葡萄糖37_47g/L，酵母膏 10-17gL，甘氨酸 6-7mgL，MgSO4 ·7Η20 O. 8-1. IgL, KH2PO4O. 9-1. lg/L，装料系数体积比为O. 6-0. 8，接种量按体积比为13-16%，培养温度为23-37°C，通气量为O. 9-1. lL/min，搅拌转速为170-190r/min，发酵时间为9-11天；将发酵液抽滤、浓缩后，加入其2_4倍体积的质量分数为90%-100%的乙醇于4°C醇沉18-25h，将醇析液以4000_5000r/min离心8_10min，去上清，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤21次，然后用蒸馏水溶解，采用赛沃杰法脱蛋白，在体积百分浓度为30%的H2O2中50-55°C保温进行脱色处理后，蒸馏水常温透析20-30小时，-48^-50V冷冻干燥，所得到的粒毛盘菌胞外多糖。
3.如权利要求I所述以菌种保藏编号为CCTCCNo:M 2011196的粒毛盘菌产胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用，特征在于加工成片剂取上述制备的300-600g粒毛盘菌胞外多糖，与药用辅料稀释剂200-250g和助流剂30-60g混匀后，再与250_600mL乙醇混合均匀制得软材，将该软材过筛得到的湿颗粒干燥后整粒，最后加入润滑剂3-10g混匀后压片，制成片剂1000片；所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌。
4.如权利要求I所述以菌种保藏编号为CCTCCNo:M 2011196的粒毛盘菌产胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用，特征在于加工成胶囊剂取药用辅料稀释剂200-270g、助流剂40-70g和润湿剂3-6g混匀后，与上述制备的300-600g粒毛盘菌胞外多糖混合均匀后分装入1000粒1#空心胶囊内，制得胶囊剂1000粒；所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。
全文摘要
本发明公开了一种以粒毛盘菌胞外多糖作为制备预防胃溃疡药物的应用，将菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌所产胞外多糖粉末用0.9%生理盐水配置成剂量为100-400mg/mL的水溶液，给药体积为10mL/kg，灌胃小鼠2周后，取胃，观察并测定溃疡面积，计算胃溃疡指数，测定小鼠的胃蛋白酶活性、胃液量、胃液总酸度及小鼠血清中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量；本发明经实验证实，菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌产胞外多糖不仅能有效预防小鼠胃溃疡，且无毒副作用，其制备方法简单经济，故可将粒毛盘菌胞外多糖应用于制备成片剂或胶囊剂型预防胃溃疡的药物。
文档编号C12R1/645GK102949409SQ201210443889
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者叶明 , 袁如月, 卢向中, 吴艳娜, 卢国忠, 叶刘生 申请人:合肥工业大学, 安徽卢氏生态科技有限责任公司