一种水溶性粒毛盘菌黑色素及其作为促排铅药物的用途
【专利摘要】本发明公开了一种水溶性粒毛盘菌黑色素及其在制备促排铅药物中的用途，特征是该水溶性粒毛盘菌黑色素是将菌种保藏编号为CCTCC?No:M2011054的粒毛盘菌所产胞内黑色素，经氯乙酸修饰后，得到的水溶性粒毛盘菌黑色素；通过对染铅小鼠促排铅的作用药理实验，表明该水溶性粒毛盘菌黑色素具有显著的促排铅功能，且无毒副作用，克服了现有西药在排铅的同时，会导致的体内一些必需元素如Zn，Cu，Fe等的损失及某些器官造成损坏的副作用缺点，确立水溶性粒毛盘菌黑色素的促排铅作用。本发明方法简单经济，可将水溶性粒毛盘菌黑色素应用于制备片剂或胶囊剂型的促排铅药物服用。
【专利说明】一种水溶性粒毛盘菌黑色素及其作为促排铅药物的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于粒毛盘菌黑色素在制备药物中的应用【技术领域】，具体涉及菌种保藏编号为CCTC CNo:M2011054的粒毛盘菌(Lachnum)的胞内黑色素采用氯乙酸修饰改性后的水溶性黑色素，及其作为制备促排铅药物的用途。
【背景技术】
[0002]铅是威胁人类生命安全和健康的常见重金属之一。随着经济的发展，铅污染已经从职业环境向日常生活环境扩展。铅对身体的各个器官系统具有毒性，会削弱机体的抵抗力，增加机体对细菌、病毒的易感性和肿瘤的发生率。目前排铅通常采用西药，往往都是在出现明显中毒症状后服用，但不良反应大，不适于长期服用。因此，从天然产物中寻找促排铅的药物具有重要的意义。
[0003]黑色素是一类结构复杂多样的酚类或吲哚类色素的总称，来源于动物、植物及微生物，一般只溶于碱液，不溶(或微溶)于水及常见的有机溶剂。生物体内的黑色素常被视为一道天然有机屏障，其具有螯合金属离子能力、抗辐射、抗氧化能力。
[0004]粒毛盘菌属(Lachnum sp.)是广泛分布于世界各地的一类腐生性真菌,近几年，本课题组发现一些粒毛盘菌菌株在深层发酵条件下可产生大量的活性多糖、色素、多酚等。如中国《食品科学》(2009, 30:185-189)及荷兰《国际生物大分子杂志》(Internat1nalJournal of B1logical Macromolecules, 2014, 63:170-176)介绍了粒毛盘菌一些菌株深层发酵后可产生大量黑色素，具有较强的抗氧化、抗辐射等活性。中国专利号ZL201110072469.2公开了本发明人课题组的一株保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌YM-292(本发明人课题组自定的编号代码)液态发酵制备胞内黑色素的方法，所制备的胞内黑色素具有较强的光保护作用，且经过毒理性试验证实其安全无毒，但其室温下在水中溶解度仅为0.llg/100g。该粒毛盘菌黑色素难溶于水，限制了其在医药、食品等领域的应用。将非水溶性黑色素改性为水溶性黑色素，便于人体吸收利用，可充分发挥其保健功能，具有重大意义。目前，国内外对黑色素进行改性的研究较少。中国专利号ZL201210218401.5公开了本发明人课题组的一种将粒毛盘菌胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法，采用黑色素与精氨酸或组氨酸或赖氨酸和水，按质量比为1:0.5~1.5:4.5~50混合，震荡至黑色素固体溶解后，将溶液冷冻干燥得到水溶性粒毛盘菌黑色素，在O~40°C水中的溶解度提高到了 3.85~4.65g/100g。目前国内外未见有公开文献提及将粒毛盘菌黑色素采取羧甲基化修饰以改性为水溶性黑色素，以及将其作为制备促排铅药物的应用方面的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种采取羧甲基化修饰改性的菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011054的粒毛盘菌水溶性黑色素及其在制备促排铅药物中的用途，确立菌种保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌水溶性黑色素促排铅的药理作用。
[0006]本发明的可作为制备促排铅药物用途的水溶性粒毛盘菌黑色素，其特征在于:是将菌种保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌发酵后提取纯化制备得到的胞内黑色素，再对该胞内黑色素采用氯乙酸进行修饰改性后得到的水溶性粒毛盘菌黑色素；即，按:将300mg粒毛盘菌胞内黑色素溶于由5mL浓度为2.0moI/L的NaOH和12mL异丙醇的混合溶液，冰浴中搅拌3h，在搅拌状态下再缓慢加入3g氯乙酸和由5mL浓度为2.0mol/L的NaOH和12mL异丙醇的混合液，室温下反应3h，在60°C继续加反应2h后，溶液冷却至室温，加入冰醋酸调节PH至中性，将该溶液于截留分子量为200Da的透析袋中先用自来水透析3d再用蒸馏水透析ld，收集、浓缩溶液，冷冻干燥后，所得到的水溶性粒毛盘菌黑色素。
[0007]本发明的水溶性粒毛盘菌黑色素在制备促排铅药物中的用途，其特征在于:是将采用氯乙酸对菌种保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌发酵后提取纯化制备得到的胞内黑色素再进行氯乙酸修饰改性后得到的水溶性粒毛盘菌黑色素，通过对染铅小鼠促排铅的作用药理实验，确立水溶性粒毛盘菌黑色素的促排铅作用；从而按药剂学的常规制备方法，将有效量的该水溶性粒毛盘菌黑色素与药用辅料混合加工制备成口服片剂或胶囊服用。
[0008]由于本发明采用的水溶性粒毛盘菌黑色素，是通过将菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011054的粒毛盘菌的胞内黑色素，按300mg溶于由5mL浓度为2.0mol/L的NaOH和12mL异丙醇的混合溶液，冰浴中搅拌3h，在搅拌状态下再缓慢加入3g氯乙酸与由5mL浓度为2.0mol/L的NaOH和12mL异丙醇的混合液，室温下反应3h，在60°C继续加反应2h后，溶液冷却至室温，加入冰醋酸调节PH至中性，将该溶液于截留分子量为200Da的透析袋中先用自来水透析3d再用蒸馏水透析ld，收集、浓缩溶液，冷冻干燥后，所得到的水溶性粒毛盘菌黑色素。这样将改性前原来室温下在水中溶解度仅为0.llg/100g的难溶的粒毛盘菌黑色素，通过采用氯乙酸修饰改性后提高到了溶解度为3.75g/100g的水溶性粒毛盘菌黑色素，解决了原保藏号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌(Lachnum singerianum)胞内黑色素由于难溶于水而不适合用于医疗、食品等领域的问题，对于扩展黑色素的应用领域和适用范围具有积极意义。实验表明，该水溶性粒毛盘菌黑色素具有显著的促排铅功能，且无毒副作用，克服了现有西药在排铅的同时，会导致的体内一些必需元素如Zn，Cu, Fe等的损失及某些器官造成损坏的副作用缺点。本发明方法简单经济，可将该水溶性粒毛盘菌黑色素应用于制备片剂或胶囊剂型的促排铅药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为非水溶性原粒毛盘菌(Lachnum)CCTCC No:M2011054胞内黑色素的红外光谱图；
[0010]图2为本发明的采用氯乙酸对粒毛盘菌(Lachnum)CCTCC No:M2011054胞内黑色素进行修饰改性后的水溶性黑色素的红外光谱图。
【具体实施方式】
[0011]下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步具体详细的说明。
[0012]实施例1:
[0013]一、粒毛盘菌胞内黑色素(LIM)的制备:
[0014]将菌种保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌接种于100L发酵罐，培养基配方为:酪氨酸浓度为1.0mmol/L,铜离子浓度为1.lmmol/L,鹿糖质量为25.5g/L,酵母膏5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH8.0，装料系数体积比为0.7，接种量为5% (v/v)，培养温度为27°C，通气量为l.0L/min，搅拌转速为180r/min，发酵时间为12d ;将发酵液抽滤，收集菌丝体，60°C烘干，按菌丝体的质量(g)与浓度为lmol/L的氢氧化钠(mL)比为1:100混匀，30°C静置12h，抽滤得浸提液；向上述浸提液加入lmol/LHCl调节pH为I~2，静置12h后将上述悬浮液离心，所得到的沉淀经去离子水洗涤至PH为7后，真空冷冻干燥，即得黑色素粗品；再将该黑色素粗品加入7mol/LHCl后于100°C酸解2h，除去与黑色素结合的蛋白质及碳水化合物。酸解后，抽滤得沉淀，沉淀经双蒸水洗涤至上清液PH值为7时重新溶于Imol/LNH3.H2O溶液，旋转蒸发仪蒸去NH3至溶液pH为中性后，依次经乙酸乙酯、氯仿、无水乙醇萃取，以除去脂类物质，萃取后旋转蒸发除去有机相，水相调PH值为2，以5000r/min离心1min,分离得到的沉淀经去离子水反复洗涤至上清液Cl _定性检测为阴性后，真空冷冻干燥，即得到菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011054的粒毛盘菌胞内黑色素(UM)。
[0015]二、水溶性粒毛盘菌黑色素(CM-UM)的制备
[0016]将上述制备得到的LIM取300mg,溶于由5mL浓度为2mol/L的Na0H、12mL异丙醇的混合溶液，制备该相同的混合溶液7份，冰浴中搅拌3h后，搅拌条件下分别加入1.50、
2.00,2.50,3.00,3.50,4.00和4.50g的氯乙酸溶液，然后再分别加入由5mL浓度为2mol/L的NaOH和12 L异丙醇的混合溶液，继续在室温条件下反应3h，然后在60°C反应此后，冷却至室温，分别加入冰醋酸调节PH至中性，室温下振荡溶解，再进行离心分离，分别取上清液稀释20倍后测定溶液的吸光度值，以溶液的最大吸光度值来确定氯乙酸的添加量，其中氯乙酸的添加量为3g时，溶液的吸光度值达到最大(0.347±0.012)，当黑色素与氯乙酸质量比小于0.1时，溶液的吸光度值基本保持在0.347-0.359范围内。可此可知1:10为氯乙酸与黑色素的最佳质量比。溶液于截留分子量为200Da的透析袋中，先用自来水透析3d、再用蒸馏水透析ld，进行浓缩冷冻干燥后，得到水溶性黑色素(CM-LIM)。对其进行复溶实验，结果表明该羧甲基-黑色素(CM-LIM)复溶效果较好，在30°C条件下蒸馏水中的溶解度为 3.75g/100g。
[0017]三、水溶性粒毛盘菌黑色素(CM-UM)的结构验证
[0018]分别取上述改性前的粒毛盘菌胞内黑色素、采用氯乙酸修饰改性制备的水溶性粒毛盘菌黑色素5mg，分别与400mg的KBr研磨后压片，采用傅里叶变换红外光谱仪(NexuS670)进行IR光谱分析，扫描范围是4000-400(^'图1为改性前的粒毛盘菌(Lachnum)CCTCC No:M2011054胞内黑色素的红外光谱图；图2为本发明的采用氯乙酸对粒毛盘菌(Lachnum)CCTCC No:M2011054胞内黑色素进行修饰改性后的水溶性黑色素羧甲基-黑色素(CM-UM)的红外光谱图。对比分析这两个红外光谱图的结果表明，改性前后的粒毛盘菌CCTCC No:M209193胞内黑色素均具有真菌黑色素的特征吸收峰，在1370CHT1处具有黑色素与羧甲基基相连的亚甲基的特征吸收峰，在3280(^^240(3!^1处吸收峰明显减弱，在1630CHT1处羧基吸收峰明显增强，说明LIM分子中的活泼氢被羧甲基取代，分子中羧基浓度增加。该结果表明氯乙酸对粒毛盘菌胞内黑色素改性成功。
[0019]四、粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性粒毛盘菌黑色素(CM-LIM)的促排铅作用药理实验:
[0020](I)粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素生理盐水溶液的制备:将上述粒毛盘菌胞内黑色素及其通过采用氯乙酸对粒毛盘菌胞内黑色素进行修饰改性后的水溶性黑色素粉末，用质量百分浓度为0.9%的生理盐水分别配制成50mg/mL和200mg/mL的水溶液，采取的给药体积为0.2mL/只，I次/d，连续3周。
[0021 ] (2)动物:昆明小鼠60只，雄性，体重25 ± 2g，SPF级，随机分为6组。
[0022](3)试剂盒:超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-PX)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒，为南京建成生物工程研究所生产的产品。
[0023](4)方法:昆明小鼠，称重后随机分为正常组、染铅模型组、UM低剂量组(50mg.kg-1)、LIM 高剂量组(200mg.kg—1)、CM-LIM 低剂量组(50mg.kg’、CM-LIM 高剂量组(200mg.kg—1)，正常组每日饮用蒸馏水，其它各组均自由饮用含Pb2+浓度为400mg/L醋酸铅[Pb(CH3COO)2.3H20]的蒸馏水溶液，各组均自由进食标准饲料。
[0024]对UM(低、高)剂量组在染铅的组每日分别灌胃50mg/kg、200mg/kg剂量的UM，CM-UM(低、高)剂量组在染铅的同时每日分别灌胃50mg/kg、200mg/kg剂量CM-UM ;各组小鼠每天定时灌胃，灌胃体积为0.2mL/只，I次/d，连续3周，灌胃期间，每日观察小鼠的一般活动、皮毛、反应能力等情况，测定小鼠体重，每天仔细收集小鼠的粪便，分别冻存备用；于末次灌胃后禁食不禁水12h，称体重后，摘眼球取血于经抗凝处理的离心管中备用；脱颈椎处死小鼠，取出小鼠肝脏、肾脏并仔细剥离小鼠的脑浆和股骨，冻存备用。
[0025](4)相关指标测定:
[0026]小鼠血清、脑、肝脏、肾脏、股骨、粪便中铅含量的测定
[0027]小鼠血清、脑、肝脏、肾脏的SOD酶活力、GSH-PX酶活、MDA酶活的测定:小鼠眼球取血,5000r/min离心3min,取血清放于_20°C备用。临用前恢复至室温，按照试剂盒说明书步骤进行操作，测定SOD酶活力、GSH-PX酶活力、MDA酶活力。
[0028](5)药理实验结果:
[0029]表1给出了上述粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素对染铅小鼠体重的影响。
[0030]表1粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素对染铅小鼠摄食量、体重的影响
[0031]
【权利要求】
1.一种可作为制备促排铅药物用途的水溶性粒毛盘菌黑色素，其特征在于:是将菌种保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌发酵后提取纯化制备得到的胞内黑色素，再对其采用氯乙酸进行修饰改性后得到的水溶性粒毛盘菌黑色素；即，按:将300mg粒毛盘菌胞内黑色素溶于由5mL浓度为2.0moI/L的NaOH和12mL异丙醇的混合溶液，冰浴中搅拌3h，在搅拌状态下再缓慢加入3g氯乙酸与由5mL浓度为2.0moI/L的NaOH和12mL异丙醇的混合液，室温下反应3h，在60°C继续加反应2h后，溶液冷却至室温，加入冰醋酸调节pH至中性，将该溶液于截留分子量为200Da的透析袋中先用自来水透析3d再用蒸馏水透析ld，收集、浓缩溶液，冷冻干燥后，所得到的水溶性粒毛盘菌黑色素。
2.权利要求1所述水溶性粒毛盘菌黑色素在制备促排铅药物中的用途。
3.如权利要求2所述水溶性粒毛盘菌黑色素在制备促排铅药物中的用途，特征在于:按药剂学的常规制备方法将有效量的水溶性粒毛盘菌黑色素与药用辅料混合加工制备成片剂或胶 囊。
【文档编号】A61P39/02GK104069133SQ201410306301
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】叶明 , 李兰, 宋升 , 珐娜 申请人:合肥工业大学