粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其制抗肾衰药的用途
【专利摘要】本发明公开了一种粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制备抗慢性肾衰药物中的用途，特征是将菌种保藏编号为CCTCC?No:M?2011196的粒毛盘菌胞外多糖，经氯乙酸羧甲基化修饰后得到的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物，根据其具有显著地抗慢性肾衰作用，按照药剂学的常规制备方法，将有效量的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物与药用辅料制备成片剂、胶囊供临床用。药效学实验证明，该胞外多糖及其羧甲基化衍生物不仅具有显著的抗慢性肾衰作用，且无毒副作用，其制备方法简单经济。
【专利说明】粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其制抗肾衰药的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于粒毛盘菌胞外多糖在医药领域中的应用，具体涉及菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制备抗肾衰药物中的用途。
【背景技术】
[0002]现代医学认为，肾脏是人体重要的排泄器官，其主要功能是过滤形成尿并排出代谢废物，调节体内的电解质和酸碱平衡。慢性肾衰竭是由各种原发性肾脏疾病或继发于其他疾病引起的肾脏进行性损伤，以代谢产物潴留、水和电解质紊乱、酸碱平衡失调，全身各系统受损为主要表现的临床综合征，已成为全球性的公共健康问题。血液透析及肾移植可以治疗慢性肾衰竭终末期肾病，但是价格较为昂贵，难以普及，临床上使用的药物通常为海昆肾喜胶囊、尿毒清颗粒等，但长期服用易出现胃脘不适、纳差、肝功能损伤等不良反应。因此研究新型无毒副作用的天然的保护慢性肾衰竭的药物具有重要的意义。
[0003]真菌多糖是一类天然高分子化合物，由醛基和酮基通过糖苷键连接，具有控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性，可做为免疫增强剂和免疫激活剂，被称为“生物反应调节物”。英国《碳水化合物聚合物》(Carbohydrate Polymers, 2009，78:658-665)中报道，多糖的分子结构决定其活性，可对多糖进行硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙酰化等分子修饰，通过改变多糖在水溶液的链构象来提高其活性，不同的取代基团、取代位置和取代度对多糖衍生物的活性有重要的影响。多糖羧甲基化修饰可以提高多糖原有活性，且能为多糖增添新的活性。
[0004]粒毛盘菌属是一类腐生性真菌，在液态深层培养条件下可产生大量的活性多糖，具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗衰老、降脂利肝及抗肿瘤等活性。中国《食品科学》(2010，30(9):276-278)曾报道了对白术多糖的抗慢性肾衰竭活性的研究冲国专利申请号201110184104.9公开了一株保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌YM281(本发明人课题组自定的编号代码)多糖在制备降脂利肝药物中的应用，显示粒毛盘菌多糖具有显著的降脂利肝作用；英国《碳水化合物聚合物》(Carbohydrate Polymers, 2013, 97, 690-694)公开了粒毛盘菌多糖磷酸化修饰及其抗肿瘤活性研究，结果表明经磷酸化修饰后，粒毛盘菌多糖的抗肿瘤活性明显增强。但目前国内外未见有公开文献提及粒毛盘菌胞外多糖的羧甲基化衍生物及其作为制备抗慢性肾衰药物的应用方面的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种菌株保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制备抗肾衰药中的用途，确立菌株保藏编号为CCTCC No:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物的抗慢性肾衰的药理作用。
[0006]本发明的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物，其特征在于是将菌株保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌发酵提取纯化后得到的胞外多糖进行羧甲基化修饰，按:取Ig粒毛盘菌胞外多糖溶于50ml 2.0mol/L NaOH溶液中，在200-400r/min转速搅拌下加入5g氯乙酸，于60°C继续搅拌反应3h，冷却至室温，用冰乙酸中和至pH为7.0，过滤后将滤液用截留分子量为3500Da的透析袋透析36-48h，收集透析袋内溶液加入其体积4~5倍的体积比浓度为95%的乙醇于4°C醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸馏水复溶，冷冻干燥后，所得到的多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b ;其基本结构为(1→ 3)-，(1 →6)-β-D-匍聚糖，其中羧甲基基团-CH2COOH与其C-3羟基的O连接。
[0007]本发明的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制备抗肾衰药中的用途，其特征在于通过小鼠慢性肾衰的药理实验，确立菌株保藏编号为CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物的抗慢性肾衰的药理作用；该菌株保藏编号为CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物可用于制备抗肾衰药物:按药剂学的常规制备方法加工成口服制剂，即，将有效量的菌株保藏编号为CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物与药用辅料混匀后制备成片剂或胶囊剂供临床用。
[0008]本发明中采用氯乙酸对菌株保藏编号为CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盘菌胞外多糖进行羧甲基化修饰，经IR和13C NMR光谱结果验证羧甲基化修饰成功，其基本结构为(I→ 3) -，(I → 6) - β -D-葡聚糖，羧甲基基团-CH2COOH与其C-3羟基的O连接，通过改变分子结构、取代基团和取代度，增强了其抗肾衰作用。经药效学实验表明，粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物具有显著地抗肾衰的作用，方法简单且成本低廉，无毒副作用，克服了长期服用现有药物出现的胃脘不适、纳差、肝功能损伤等不良反应。
[0009]本发明的菌株保藏编号为CCTCC Νο:Μ 2011196粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物，经药效学实验表明，能有效改善腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠肾脏病理组织状态，明显的降低血清中肌酐和尿素氮含量，增加总蛋白及白蛋白含量，增强小鼠肾、肝匀浆液中S0D、GSH-PX、CAT和GSH的活性，降低MDA含量。因此可将粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物应用于制备片剂或胶囊剂型的抗慢性肾衰药物。该方法简单经济。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为粒毛盘菌CCTCC No:M 2011196胞外多糖的IR光谱图；
[0011]图2为粒毛盘菌CCTCC No:M 2011196胞外多糖羧甲基化衍生物的IR光谱图；
[0012]图3为粒毛盘菌CCTCC No:M 2011196胞外多糖的13C NMR光谱图；
[0013]图4为粒毛盘菌CCTCC No:M 2011196胞外多糖羧甲基化衍生物的13C NMR光谱图；
[0014]图5到图11分别给出了经粒毛盘菌多糖及其羧甲基化衍生物治疗后慢性肾衰小鼠肾脏组织病理学检查结果照片。其中图5为正常组，图6为模型组，图7为阳性组，图8为LEP-1b低剂量组，图9为LEP-1b高剂量组，图10为CLEP-1b低剂量组，图11为CLEP-1b高剂量组小鼠肾脏组织病理学检查的照片。
【具体实施方式】
[0015]实施例1:
[0016]一、粒毛盘菌YM281胞外多糖制备:
[0017]采用中国专利申请号201110184104.9中所公布的方法，将菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011196(YM281)的粒毛盘菌接种于5L发酵罐，培养基配方为:葡萄糖45g/L，酵母膏14g/L，甘氨酸6.0mg/L，MgSO4 WH2OlgA^KH2PO4Ig/!,装料系数体积比为0.7，接种量为15%(体积比)，培养温度为35°C，通气量为l.0L/min，搅拌转速为180r/min，发酵时间为12天；将发酵液抽滤、浓缩后，加入其3倍体积的体积比浓度为95%的乙醇于4°C醇沉24h，将醇析液以5000r/min离心IOmin,去上清,所得沉淀用蒸懼水溶解,采用赛沃杰法(Sevag法)脱蛋白，加入样液体积1/3的H2O2保温(50°C)脱色处理后，使用3500Da的透析袋，先用自来水透析72h再用蒸馏水透析48h，_50°C冷冻干燥，即得菌种保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌胞外多糖LEP-1b。
[0018]二、粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物制备:
[0019]参照日本《生物学与药学通报》(Chemical and PharmaceuticalBulletin, 1988，36 (3): 1016-1025)中公布的羧甲基化修饰方法，对粒毛盘菌YM281胞外多糖进行羧甲基化修饰以形成羧甲基化衍生物:取菌株保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌发酵提取纯化后得到的胞外多糖Ig LEP-1b溶于50ml 2.0mol/L NaOH溶液中，在200-400rpm转速搅拌下加入5g氯乙酸，于60°C继续搅拌反应3h，冷却至室温，用冰乙酸中和至PH为7.0,过滤后将滤液用截留分子量为3500Da的透析袋透析36_48h，收集透析袋内溶液加入其体积4-5倍的体积比浓度为95%的乙醇于4°C醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸馏水复溶，溶液冷冻干燥得到菌株保藏编号为CCTCC No:M 2011196的粒毛盘菌(YM281)胞外多糖羧甲基化衍生物，其羧甲基化产物得率为78.4%，羧甲基化取代度DS为
1.433。
[0020]三、粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物结构鉴定:
[0021]分别取LEP-1b和CLEP-lb6mg与IOOmg KBr混合研磨后压片，于4000-400^^1使用傅里叶变换光谱仪(NexuS670)进行红外光谱扫描，图1和图2分别给出了粒毛盘菌YM281胞外多糖LEP-1b和粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b的IR光谱图。
[0022]由图1中所示，LEP-1b的红外光谱中3350CHT1处的吸收峰是O-H伸缩振动引起的，2930cm-1处的吸收峰是C-H伸缩振动引起的，1650cm-1处出现的吸收峰为结合水所产生的H-O-H弯曲振动峰，1050cm—1处的吸收峰是C-O-C不对称伸缩振动引起的，表明LEP-1b具有典型的(I — 3) -，(I — 6) - β -D-葡聚糖的特征吸收峰。由图2中所示，CLEP-1b中1650(^1处由结合水所产生的H-O-H弯曲振动吸收峰消失，1600cm_\l420cm_1和1330CHT1处出现的新吸收峰，分别是由羰基中C=O键的不对称伸缩振动、C-O伸缩振动和次甲基的振动引起，表明LEP-1b羧甲基化修饰成功。
[0023]分别取LEP-1b 和 CLEP-1b 样品各 20.0mg 分别溶于 Iml D20,90 °C 于 BrukerAvance AV500兆核磁共振仪上进行13C NMR核磁光谱分析。图3和图4分别给出了粒毛盘菌YM281胞外多糖LEP-1b和粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物的13C NMR光谱图。如图3中所示，LEP-1b的13C NMR图谱中化学位移为102.817ppm的异头碳信号是—3)-β-D-Glcp-(I —的C-1产生的，表明糖环构型为吡喃型；C-2、C_3、C_4、C_5、C_6的化学位移分别为 70.637ppm、78.769ppm、67.481ppm、73.902ppm、63.352ppm。如图 4 中所示，CLEP-1b的13C NMR图谱中出现两个新的吸收峰，化学位移为178.890ppm的吸收峰是C=O的特征吸收峰，化学位移为17.416ppm的吸收峰是次甲基的特征吸收峰，说明LEP-1b中引入了 -CH2COOH基团，化学位移为78.769ppm的C-3信号峰消失，说明羧甲基基团-CH2COOH与LEP-1b 的 C-3 羟基中 O 结合。除此之外，CLEP-1b 的 13C NMR 图谱中 C-1、C-2、C-4、C-5、C_6的化学位移与LEP-1b相比均未发生变化。
[0024]上述IR和13C NMR光谱结果表明，LEP-1b羧甲基化修饰成功，羧甲基基团-CH2COOH与LEP-1b C-3羟基的O连接。
[0025]四、粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物对小鼠抗慢性肾衰作用的药理实验:
[0026](I)粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物生理盐水溶液的制备:将上述粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物粉末用质量百分浓度为0.9%的生理盐水分别配置成100mg/mL和200mg/mL的水溶液,采取的给药体积为0.25mL/每只小鼠。
[0027](2)动物:昆明雄性小鼠70只，体重20±2g。
[0028](3)试剂:腺嘌呤购自洛阳德胜化工有限公司(河南、中国)，海昆肾喜胶囊购自辉南长龙生化药业股份有限公司(吉林、中国)，血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(江苏、中国)、总蛋白(TP)和白蛋白试剂盒购自南京建成生物工程研究所(江苏、中国)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GSH)和丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(江苏、中国)。
[0029](4)方法:采用腺嘌呤灌胃法建立小鼠慢性肾衰竭模型。健康雄性昆明小鼠70只，适应性喂养一周后，随机取出10只作为正常组(对照)，生理盐水灌胃(10mL/kg)，其余小鼠用300mg/Kg.d腺嘌呤灌胃给药，每天一次，连续21天，检测小鼠血肌酐和尿素氮含量。小鼠血肌酐含量高于115mM/L和尿素氮含量高于8.05mM/L时表不建模成功。取建模成功小鼠随机分成6组，每组10只，分别为:模型组(生理盐水10mL/kg)、阳性组(海昆肾喜胶囊150mg/Kg)、LEP-1b 低剂`量组(100mg/Kg)、LEP-1b 高剂量组(200mg/kg)，CLEP-1b 低剂量组(100mg/Kg)、CLEP-1b 高剂量组(200mg/Kg)。连续给药 28 天。
[0030](5)相关指标测定:
[0031]小鼠摄食量、体重和肾脏指数测定:
[0032]给药过程中，每天测定摄食量，取平均值。末次给药后，小鼠称体重，脱颈椎处死，取双侧肾脏，称质量，计算肾脏指数。
[0033]肾脏指数=双肾质量/小鼠体重X 100%
[0034]肾脏组织病理学检查:
[0035]取单侧肾脏，置AFF固定液中固定，0.C.T.包埋剂包埋、切片，HE (Haematoxylinand Eosin)染色，光学显微镜下观察拍照。
[0036]小鼠血液生化指标测定:
[0037]小鼠脱颈椎处死后眼球采血，所得血液室温静置半小时自然凝血，5000r/min离心5min，取血清4°C保存，用于测定小鼠血液生化指标，包括BUN、Scr、TP、ALB等。按试剂盒说明书方法检测。
[0038]小鼠肾、肝组织匀浆的抗氧化物酶活等指标测定:
[0039]准确称取小鼠肾组织、肝重量，按重量(g):体积(mL)=l:10的比例加入匀浆介质(质量分数为0.9%的生理盐水)，冰水浴条件下机械匀浆，3000r/min离心lOmin，取上清得质量分数为10%组织匀浆液，分别测定匀浆液中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA的含量。按照试剂盒说明书方法检测。
[0040](6)药理实验结果:
[0041]表1给出了上述粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物对肾衰小鼠摄食量、体重和肾脏指数的影响。
[0042]表1 LEP-lb、CLEP-1b对肾衰小鼠摄食量、体重和肾脏指数的影响
【权利要求】
1.一种粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物，其特征在于是将菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌发酵提取纯化后得到的胞外多糖进行羧甲基化修饰，按:取Ig粒毛盘菌胞外多糖溶于50ml 2.0mol/L NaOH溶液中，在200-400r/min转速搅拌下加入5g氯乙酸，于60°C继续搅拌反应3h，冷却至室温，用冰乙酸中和至pH为7.0，过滤后将滤液用截留分子量为3500Da的透析袋透析36-48h，收集透析袋内溶液加入其体积4~5倍的体积比浓度为95%的乙醇于4°C醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸馏水复溶，冷冻干燥后，所得到的多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b ;其基本结构为(1 — 3)-，(I — 6)-β-D-葡聚糖，其中羧甲基基团-CH2COOH与其C-3羟基的O连接。
2.权利要求1所述粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制抗肾衰药中的用途，其特征在于菌株保藏编号为CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物用于制备抗慢性肾衰的药物。
3.如权利要求2所述的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制抗肾衰药中的用途，特征在于所述制备抗慢性肾衰的药物，是按照药剂学的常规方法，将有效量的菌株保藏编号为CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物与药用辅料混匀后制备成片剂或胶囊。
【文档编号】A61K31/715GK103755827SQ201410020149
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】叶明 , 吴艳娜, 荆莲艳 申请人:合肥工业大学