作为转染试剂的羧化多胺衍生物的制作方法
【专利说明】作为转染试剂的羧化多胺衍生物 发明领域
[0001] 本发明涉及多胺衍生物以及多胺衍生物用于将核酸和其它聚阴离子转染至细胞 中的用途。本发明还涉及一种用于将聚阴离子转染至细胞中的方法，以及涉及用于此的试 剂盒和多胺衍生物。本发明的多胺衍生物是有效的转染剂（transfectants)，具有非常低的 毒性，可用于转染多种不同的细胞类型。
【背景技术】
[0002] 转染是将外源物质引入至细胞中。在转染的背景之下，"至细胞中"意指运输外源 物质穿过至少一层生物膜。可进一步运输至细胞区室或细胞器中。相比之下，仅仅是将物 质包含在核内体、胞饮或吞噬小泡或者溶酶体中不被认为是转染。
[0003] 外源物质可包含诸如肽、蛋白质以及各种类型的核酸的分子；后者可小至如寡核 苷酸或者长至如质粒。外源物质也可包含此类分子的装配物（assemblies)。在任何情况 下，上述分子或装配物是大的且亲水的，这两个特征阻碍了它们独力的细胞摄取。因此转染 需要使用特定的辅助试剂。除其它之外，多胺可为此类试剂。多胺在溶液中形成聚阳离子， 促进与诸如核酸的聚阴离子的复合物（complex)形成。这些复合物是实际的能胜任转染的 实体（transfection competent entities) 〇
[0004] Boussif 等人（Proc Natl Acad Sci USA (1995)，监（16) :7297-7301)或者在 US6013240中）使用支链的聚亚乙基亚胺（polyethyleneimine，PEI)作为多胺，证明了多 胺和质粒的复合物的转染。在持续该观念的同时，其他人试图通过各种手段来改进该技术。 改进转染剂的策略包括：
[0005] ⑴选择特定尺寸或构型的聚阳离子，例如具有特定长度的直链的 PEI(ff02009/016507)；
[0006] (ii)使用此类聚阳离子的在代谢上不稳定的多聚体（Gosselin等人（2001) Bioconj Chem, 11(6) :989-994 ;Lynn 等人（2001) J Am Chem Soc 123(33) :8155-8156; Gdpfrich等人的 W02007/020060 Janaka 等人的 W02007/120479);
[0007] (iii)使用脂质混合物（Monahan等人的US7, 601，367);或者
[0008] (iv)对聚合物主链进行化学改性，例如芳香族氨基酸的接枝（在Adib等人的 W02009/074970中）、组氨酸或咪唑基团的接枝（在W02009/011402中）、如Wakefield等人 (2005)Bioconj Chem 16(5) :1204-1208中的烷基化或者利用胆固醇的改性（在Ferguson 等人的 US2007/0154447 中）。
[0009] 疏水改性改善了转染剂的膜渗透（见于Wakefield等人），但与溶液中的复合物 的低稳定性相关；配制的材料倾向于形成聚集体。聚乙二醇（PEG)的接枝（通过Matar 等人在 W02009/021017 中或者在 Rozema 等人（2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(32): 12982-12987中）抵制聚集，但另一方面其与生物活性对抗且必须为可逆的，如Rozema的发 表文献中所示。
[0010] 从许多不同的策略以及从大量的报告中显而易见的是，新型转染剂的开发是深入 研究的课题。它们的应用具有重大的商业意义；转染试剂在2011年具有约200Mio USD的 市场容量（Frost&Sullivan，Global Transfection Markets (全球转染市场），N6F0_01)。 toon] 转染剂的开发和改良中的两个最重要标准是（i)高信噪比以及（ii)穿过大量不 同细胞类型的有效转染。信噪比描述了转染复合物与单独转染剂或者与包含不相关核酸的 转染复合物相比的效果。
[0012] 因此本发明的一个目的是提供一种用于将聚阴离子转染至细胞中的转染剂以及 一种转染细胞的方法。另一个目的是提供一种在标准（a)和/或（b)方面优于市售材料的 转染剂。鉴于先前所用的大量和多样化的方法，尚未发现已教导此发明的具体原理。
[0013] 发明概沭
[0014] 上述目的通过以下方式实现：
[0015] (1)多胺衍生物用于将聚阴离子转染至细胞中的用途，所述多胺包含：
[0016] 多胺部分，所述多胺部分包含多个氨基；
[0017] 多个羧化取代基，所述羧化取代基包含经由疏水连接体与所述多胺部分的氨基结 合的羧基；以及
[0018] 多个疏水取代基，所述疏水取代基与所述多胺部分的氨基结合；
[0019] 所述疏水连接体具有3至20的logP，该IogP是对通过将所述连接体与所述多胺 的羧基以及氨基结合的键替换为与氢原子结合的键从所述连接体获得的化合物测定的；以 及
[0020] 所述疏水取代基具有1. 5至20的logP，该IogP是对通过将所述疏水取代基与所 述多胺部分的氨基结合的键替换为与氢原子结合的键从所述疏水取代基获得的化合物测 定的。
[0021] (2)多胺衍生物用于将聚阴离子转染至细胞中的用途，所述多胺包含：
[0022] 多胺部分，所述多胺部分包含多个氨基；
[0023] 多个羧化取代基，所述羧化取代基包含经由疏水连接体与所述多胺部分的氨基结 合的羧基，其中每个所述羧化取代基包含6至40个碳原子，优选6至20个碳原子，更优选 8至18个碳原子，并且每个所述疏水连接体可包含1至3个选自0、N及S的杂原子；以及
[0024] 多个疏水取代基，所述疏水取代基与所述多胺部分的氨基结合，其中每个所述疏 水取代基包含至少2个碳原子，优选6至40个碳原子，并且在所述疏水取代基具有至少6 个碳原子的情况下可包含1至3个选自0、N及S的杂原子。
[0025] (3)根据第1项或第2项的用途，其中所述多胺衍生物的每个所述羧化取代基包含 下列基团中的任何一个或多个作为所述疏水连接体：亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚 环烯基、亚芳基以及它们的组合；和/或
[0026] 所述多胺衍生物的每个所述疏水取代基包含下列基团中的任何一个或多个：烷 基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基以及它们的组合。
[0027] (4)如第1项或第2项所限定的多胺衍生物。
[0028] (5)多亚烷基亚胺（Polyalkylenimine)衍生物，其具有一个或多个羧基烷基取代 基以及一个或多个疏水取代基，所述羧基烷基取代基包含6至40个碳原子，所述疏水取代 基选自具有至少2个碳原子、优选6至40个碳原子的烃取代基，其中每个所述疏水取代基 可为烷基或者可包含烷基和/或每个所述疏水取代基可为芳基或者可包含芳基。
[0029] (6)根据第5项的多亚烷基亚胺衍生物，其中所述多亚烷基亚胺衍生物中的羧基 烷基取代基和疏水取代基具有10 :1至0. 1 :1的摩尔比（C/A比），优选这些基团的C/A比 为 3 :1 至 0· 33 :1。
[0030] (7)根据第4项至第6项中任一项的多胺衍生物或多亚烷基亚胺衍生物，其中所述 羧化取代基全部相同且所述疏水取代基全部相同，并且一个所述羧化取代基中的碳原子加 上一个所述疏水取代基中的碳原子的总数为10至30,优选为15至25。
[0031] (8)核酸或蛋白质与本发明的多胺衍生物的复合物。
[0032] (9) 一种试剂盒，包括：
[0033] (i)如本文所限定的多胺衍生物，
[0034] (ii)pH介于4至8之间的缓冲溶液，以及
[0035] (iii)任选地使用说明手册。
[0036] (10