专利名称：一种玉米油份含量相关的lacs基因位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米油份含量相关的基因的分子标记的应用，属于玉米育种和分子生物学领域。
背景技术：
玉米油是玉米加工的主要产品之一。它是一种具有多种抗氧化剂的植物油，亚油酸含量高，维生素A、维生素E的含量也相对较高。亚油酸含量及亚油酸与油酸的比例决定植物油的品质，同时维生素A、维生素E具有保健作用和药用价值。食用玉米油有利于人类的身体健康，因此玉米油具有“健康食物油”之称。我国高油玉米的研究开始于20世纪80年代，宋同明教授从国外引进ASKC23、IH0C80、Syn. D. O、ARYD等高油玉米半成品群体，从中继续选择形成亚伊高油(AIHO)、抗病高油(Syn.D. O.)、利得高油(RYDHO)等高油群体。另外，宋同明还培育了 2个具有中国特色的高油群体北农大高油群体(BHO)和抗倒坚杆高油群体(KYHHO)。BHO以综2号C3群体为基础群体，进行类似IHO的选择。首先对17，000粒种子的含油量进行单粒分析，从中选择含油量较高的150粒种子，单粒点播，并且人为地分为A、B两区，相互授粉。经过18代的选择，含油量由最初的4. 71 %提高到15. 55%，形成北农大高油玉米(BHO)。KYHHO以14个优良自交系链状杂交法构成的群体为基础群体，同时对含油量和粒重进行选择，经过7代选择，含油量由原来的3. 73%增加到11.57%。虽然国内高油玉米的选育比较晚，但所发展的高油群体含油量的提高并不亚于国际水平。脂肪酸的生物合成途径是乙酰辅酶A—月桂酸一十四酸一软脂酸一硬脂酸一油酸一亚油酸(Ohlrogge, 1995,1997 ;Buchanan, 2002)。由此可见，在油酸和亚油酸之间、饱和和不饱和脂肪酸之间存在着相互转化关系。Poneleit和Alexander (1965)的研究表明，软脂酸、油酸和亚油酸的转化是由高亚油酸单基因控制的。Widstrom等(1975)证明，油酸和软脂酸含量的不同是由单基因控制的，而决定亚油酸含量的基因为两个或多个，一个呈部分显性，另一个为隐性。Wright等(1995)把EMS诱变B73得到的高油单隐性突变体Olcl定位在第一染色体的长臂上。近年来，随着模式植物全基因组测序的完成，植物基因组学的研究已经呈现出由简单质量性状向复杂的数量性状转移的趋势，特别是大量SNP标记的开发以及生物信息学的迅猛发展，应用关联分析方法发掘植物数量性状基因已成为目前国际植物基因组学研究的热点之一。
发明内容
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的AM508群体由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成(所述的群体材料，均为常见的玉米市售材料，可通过常规商业渠道购买得到)。候选基因重测序材料155份我国骨干自交系材料。从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系，构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始数据。全基因关联分析以AM508群体为材料，利用IlluminaMaizeSNP50 BeadChip对56，110个位点进行了基因型检测。从授粉15天后的508份材料中随机选择的368份材料则构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序，每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始序列。使用高质量的SNP，分别对这两个群体采用线性混合模型校正群体层化效应和亲缘关系后与油脂相关性状进行了高密度标记的全基因组关联分析。为了综合这两个群体的结果，本研究研究使用了统一的阈值筛选显著性的位点(建议水平显著性阈值为1/N =
I.78X IO-6以及5%基因组显著性阈值为0. 05/N = 8. 94X10^)。为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点间两两的连锁不平衡，过滤掉r2小于O. 02的标记。在定位到的单一的显著性信号中。玉米长链酰基辅酶A合成酶(LACS)，位于玉米基因组第二条染色体上，该基因富含Ser/Thr/Gly结构域，具有长链乙酰辅酶A连接酶活性，该基因把游离脂肪酸活化成为长链酰基辅酶A，从而在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用，同时它还参与角质、聚酯及蜡质的生物合成。利用368份材料关联分析结果发现，位于玉米参考基因组chr2.S_149517635的SNP位点，该位点突变为T/G，其中T为主要等位基因，G为最小等位基因，最小等位基因频率为O. 05，该位点与玉米油份含量显著关联，该SNP位点与玉米长链酰基辅酶A合成酶(LACS)基因紧密连锁。玉米候选基因序列通过比对B73参考序列获得，利用PrimerPremier 5和Primer3设计引物扩增全长，利用MUSCLE软件和BioEdit软件进行多序列处理和比对，利用TASSEL 2. O. I软件提取SNP和InDel，同时通过1000次排列检验计算多态性间的r2值，采用F测验计算两个显著性信号位点间两两的连锁不平衡。测序引物序列Rl5'-GATCTATTGGACGTGAGGCG-3'5'-ACAGTAGGGTGTTACCAATGAGC-3'R25'-TTTGCTCTGCCCTGTTTGTC-35'-CAGAAGATTCCACAAATTCCCTC-3'R35'-GATCGAGCTG CTGCCTGAG-3'5'-ATATCCAACGGACAATCTACGG-3'根据LACS基因的InDel_146/472功能位点开发的标记序列如下PCR分子标记序列5'-GATCGAGCTGCTGCCTGAG-3'5'-ATATCCAACGGACAATCTACGG-3'
下面结合附图对本发明的具体实施例作进一步详细的说明。图IZmLACS基因内多态性位点与不同地区的油脂表型的关联分析；图2ZmLACS基因的结构及其功能结构域图示图3显著关联区域内的标记间两两配对的连锁不平衡展示4授粉15天后ZmLACS基因表达水平与油脂含量的相关性分析5InDel_146/472位点不同等位基因型对应的标准化后的ZmLACS基因的表达水平
具体实施例方式以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例·仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。AM508群体由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成，已在参考文献 Yang, X. H. et al. Characterization of a global germplasmcoIIection and itspotential utilization for analysis of complex quantitativetraits in maize. Mol.Breeding 121，417-431 公开过。候选基因重测序材料155份我国骨干自交系材料，已在参考文献Yang,X. H. et al.Genetic analysis and characterization of a new maizeassociationmapping panel for quantitative trait loci dissection. Theor. Appl. Genet. 121，417-431 (2010a).公开过。转录组测序材料从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系，构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始数据。表型变异AM508群体包含508个自交系(其中包括35个高油品系)油含量相关的变异丰富，软脂肪酸含量差异2. 3倍，硬脂肪酸含量差异达8倍。软脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亚麻油酸(18:2,51. 2% )和亚麻酸(18:3,1.4%)这五种脂肪酸占98. 4%的油含量。4个环境联合检测发现十个油份相关性状的遗传力均在90%以上。全基因关联分析以AM508 群体为材料，利用 Illumina MaizeSNP50 BeadChip 对 56，110 个位点进行了基因型检测。从授粉15天后的508份材料中随机选择的368份材料则构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序，每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始序列。研究使用了 106万个高质量的SNP，分别对这两个群体采用线性混合模型校正群体层化效应和亲缘关系后与油脂相关性状进行了高密度标记的全基因组关联分析。为了综合这两个群体的结果，本研究研究使用了统一的阈值筛选显著性的位点(建议水平显著性阈值为1/N = 1.78X10-6以及5%基因组显著性阈值为0. 05/N = 8. 94Χ1(Γ8)。为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点间两两的连锁不平衡，过滤掉r2小于0.02的标记。在定位到的单一的显著性信号中，有若干个位点位于或者临近于(50Kb)被前人证实报道过的已知基因内，它们在本研究中再次得到了验证。与已知的油脂代谢相关基因较远的关联位点很可能是与油脂代谢相关基因紧密连锁，则距离最近的油脂代谢基因很可能就是本研究的候选基因。玉米长链酰基辅酶A合成酶(LACS)，位于玉米基因组第二条染色体上，该基因富含Ser/Thr/Gly结构域，具有长链乙酰辅酶A连接酶活性，该基因把游离脂肪酸活化成为长链酰基辅酶A，从而在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用，同时它还参与角质、聚酯及蜡质的生物合成。利用368份材料关联分析结果发现，位于玉米参考基因组chr2.S_149517635的SNP位点，该位点突变为T/G，其中T为主要等位基因，G为最小等位基因，最小等位基因频率为O. 05，该位点与玉米油份含量显著关联，该SNP位点与玉米长链酰基辅酶A合成酶(LACS)基因紧密连锁。
权利要求
1.一种玉米油份含量相关的LACS基因位点，其特征在于，所述的基因位点为长链酰基辅酶A合成酶基因，位于玉米参考基因组(www. maizesequence. org, 5a. 60版)chr2.S_149517635的SNP，该位点突变为T/G。以及位于玉米LACS基因(GRMZM2G079236) 3’ UTR的InDel_146/472(146bp的插入/472bp的缺失和146bp的缺失/472bp的插入)位点。
2.如权利要求I所述的玉米油份含量相关的基因位点的应用，其特征在于包括以下步骤 a)由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成AM508群体； b)从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系,构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。
3.如权利要求I或2所述的玉米油份含量相关的基因位点的应用，其特征在于玉米LACS基因的InDel_146/472功能位点开发的PCR分子标记序列为5' -CGGGTGGAACTTGTTATGGC-3'5' -AGGGCACTGAATCGGAACAC-3。
4.如权利要求I或2所述的玉米油份含量相关的基因位点及其应用，其特征在于玉米基因序列通过比对B73参考序列获得,利用Primer Premier5和Primer3设计引物扩增全长，利用MUSCLE软件和BioEdit软件进行多序列处理和比对，利用TASSEL 2. O. I软件提取SNP和InDel，同时通过1000次排列检验计算多态性间的r2值，采用F测验计算两个显著性信号位点间两两的连锁不平衡。
5.如权利要求I所述的玉米油份含量相关的基因位点在玉米育种的应用。
全文摘要
本发明涉及一种玉米油份含量相关的LACS基因位点及其应用，属于植物分子育种领域。本发明的玉米油份相关的位点为位于玉米参考基因组(www.maizesequence.org，5a.60版)chr2.S_149517635的SNP，该位点突变为T/G；以及位于玉米LACS基因(GRMZM2G079236)3’UTR的InDel_146/472(146bp的插入/472bp的缺失和146bp的缺失/472bp的插入)位点。可将分子标记用于不同遗传背景下的高油玉米育种，可以用于玉米遗传改良；该方法和标记在玉米育种领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102911949SQ20121044468
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者严建兵, 杨小红, 李建生, 李慧 申请人:华中农业大学