双靶向作用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于抗体的双靶向分子，并且涉及用于产生这类双靶向分子的方法， 包括基于文库的方案。 发明背景
[0002] 本发明涉及双特异性抗体或其功能片段的新设计。
[0003] 在文献中，已经报道了产生双特异性抗体分子的多种方案。这些方案可以分成两 类：1)产生双特异性抗体样式，其中识别两个靶或两个表位的两个互补位均位于一个互补 性VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且均包含属于这个互补性VH-VL对的⑶R 残基，和2)产生其他双特异性抗体样式，其中识别两个靶或表位的两个互补位不是都位于 一个互补性VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且不是都包含属于同一个互补 性VH-VL对的CDR残基。
[0004] 在第一类方案内部，已经在文献中描述了可预测地工程化双特异性抗体分子的仅 两种方法，并且这些方法将在下文[0014]至[0015]部分中详细讨论。然而，考虑这项工作 的背景，将首先总结第二类方案。
[0005] 这种第二类方案（其中识别两个靶或表位的两个互补位不是都位于一个互补性 VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且不是都包含属于同一个互补性VH-VL对的 CDR残基）构成了非常庞大的由各种现有技术人员从事的工作，并且已经描述了这类双特 异性抗体的众多不同例子。
[0006] 在属于第二类方案中的第一组例子中，具有不同特异性的两种或更多种抗体片段 (包括Fab片段、单链Fv或单结构域抗体）通过化学键接或通过遗传融合借助一种或多种 肽接头组合。在这组例子中公开的双特异性抗体样式包括以下： a. 双体抗体（Perisic 等人，Structure. 1994 Dec 15 ;2 (12) :1217-26; Kontermann, Acta Pharmacol Sin.2005 Jan ；26 (I):1-9 ；Kontermann, Curr Opin Mol Ther. 2010 Apr ; 12 (2):176-83)。 b. TandAb 等（Cochlovius 等人，Cancer Res. 2000 Aug 15 ;60 (16) :4336-41)。 c. 通过肽接头以遗传方式融合的对不同靶特异的单结构域（例如Domantis :W0 2008/096158 ；Ablynx ：W0 2007/112940) d. 其他（综述参见：Enever 等人，Curr Opin Biotechnol. 2009 Aug ;20(4) :405-11. Epub 2009 Aug 24 ;Carter, Nat. Rev. Immunol. 6,343(2006) ;P.Kufer 等人，Trends Biotechnol. 22, 238(2004)) 〇
[0007] 为了改善它们在医学应用中的潜在用途，可以使用多种技术延长上述双特异性抗 体样式的体内血清半寿期，所述技术包括以下： a. 添加血清白蛋白或血清白蛋白结合实体 b. PEG 化 C.通过遗传融合如HAP化添加蛋白质聚合物（Schlapschy等人，Protein Eng Des Sel. 2007 Jun ;20(6):273-84 Epub 2007 Jun 26)或 XTEN(Schellenberger, Nat. Biotechnology 12 (2009) 1186)〇
[0008] 在这组例子中，双特异性抗体包含缺少Fe区的抗体片段，并因此通常不显示与新 生Fe受体FcRn天然结合，不显示完整IgG抗体的天然效应子功能（例如ADCC和CDC)，并 且通常不能按照与IgG抗体相同的方式借助超抗原衍生的亲和树脂（如对Fe区特异的蛋 白A树脂）纯化。缺少Fe区的这些后果可能限制这类双特异性抗体的可实现血清半寿期、 作为活性药物成分的可行应用和制备上经济。
[0009] 在属于第二类方案的第二组例子中，双特异性抗体包含IgG样分子和一个或几个 额外的附加结合结构域或实体。这类抗体包括其中单链Fv已经与重链或轻链的一个末端 融合的IgG-scFv融合蛋白（加利福尼亚州立大学，Biogen Idec，CAT/MedImmune)，和双可 变结构域（dvd-IgG)分子，其中额外VH结构域和接头与重链的N末端融合并且额外VL结 构域和接头与轻链的N末端融合（Abbott)。从总体上看，这些方案在构建体的制造、可及性 和稳定性方面存在缺点。
[0010] 在属于第二类方案的第三组例子中，双特异性抗体包含IgG样抗体，所述抗体已 经以这样的方式产生或修饰，从而它们在不添加其他结合结构域或实体的情况下显示出 两种特异性。这类抗体包括IgG分子，在所述IgG分子中，例如使用工程化隆起（Ridgway 等人，Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617_21)，使用链交换法（Davis 等人，Protein Eng Des Sel.2010 Apr;23(4):195-202.Epub 2010 Feb 4)，或使用工程化反电荷法（Novo Nordisk)，已经修饰天然同型二聚的CH3域以变成异二聚体，因而潜在地使得IgG样分子的 两半部分能够通过添加至Fc区、通常N端Fab区的结合实体结合两种不同的靶。在这个第 三组例子中的抗体还包括这样的IgG分子，其中修饰不天然参与抗原接触的一些结构性环 以结合除了通过可变区CDR环天然结合的一种靶之外还有的其他靶，例如通过在Fc区内点 突变（例如，与FcgRIIb结合的Xencor Fe)或通过结构性环的多样化（例如具有多样化CH3 域的f-star Mab2)。这些方案在稳定性、制造、价态和亲和力/应用有限方面存在缺点。 [0011] 与第二分类中双特异性抗体的全部以上例子相反，第一类中的双特异性抗体具有 对两种靶特异的两个互补位，所述互补位均包含位于相同异二聚VH-VL抗体可变区内部的 ⑶R残基。本领域中已经描述归属于这个第一类的仅4个类型的抗体分子。这四个类型中， 第一类型抗体不真正是双特异的，因为它不能特异性识别两种不相关的靶；第二类型抗体 天然存在，但不知道它是否可以可预测地工程化，因为没有这种研宄的例子公开；并且根据 出版物，仅第三和第四类型的抗体可以工程化，针对两种不相关的靶具有特异性。归属于这 个第一类的四类型抗体分子如下：
[0012] 交叉反应抗体，其具有与两种或更多种结构上相关的抗原或表位对应的单一宽泛 特异性。对于这类抗体，两种抗原在序列和结构上相关。例如，抗体可以与来自不同物种的 相关靶如鸡卵清溶菌酶和火鸡溶菌酶（W0 92/01047)或与处于不同状态或样式的相同靶 如半抗原和与载体缀合的半抗原（Griffiths AD等人，EMBO J 1994 13:14 3245-60)交叉 反应。可以就交叉反应性而人为地工程化抗体。例如，已经将抗体工程化以识别来自不同 物种的两种相关抗原（例如Genentech :结合人LFAl的抗体经工程化还结合恒河猴LFA1， 产生成功的药物Raptiva/依法珠单抗）。类似地，WO 02/02773描述了具有"双特异性"的 抗体分子。提到的抗体分子是针对多种结构相关的抗原产生或选择的抗体，具有可以容纳 两种或更多种结构上相关的靶的单一结合特异性。然而，如上文提到，全部这些交叉反应抗 体不真正是双特异的并且未工程化以特异性识别两种不相关的靶。
[0013] 另外，存在天然存在的多反应性自身抗体（Casali和Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531)。这些多反应性抗体具有识别结构上不相关的至少两种（通常更多 种）不同抗原或表位的能力。还已经显示，对单克隆抗体使用噬菌体展示技术对随机肽库 的选择将鉴定匹配抗原结合位点的一系列肽序列。一些序列是高度相关的，匹配共有序 列，而其他序列十分不同并且已经被称作模拟表位（mimotope) (Lane和Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271)。因此清楚的是，一些异二聚 VH-VL 抗体的结合 位点具有与不同和有时不相关抗原结合的潜力。但是，如上文提到，这类多反应性抗体可能 存在，但尚未使用本领域所述的可预测方法人为地工程化。
[0014] 本领域所述的一种方法涉及"二合一"抗体，其中所述方法允许双特异性抗体的人 为工程化，所述双特异性抗体能够通过两个互补位结合结构上不相关的两种靶，所述两个 互补位均位于一个互补性异二聚VH-VL对内部并且均包含属于这个互补性VH-VL对的⑶R 残基。使用或多或少不同于先前交叉反应性工程化方法的方法，将这些"二合一"抗体工程 化以包含两个重叠的互补位。这项研宄已经在WO 2008/027236中并且由Bostrom等人描 述（Bostrom 等人，Science. 2009 Mar 20 ;323 (5921): 1610-4)。在公开的例子中，分离对 一种靶（HER2)特异的异二聚VH-VL抗体可变区并随后将轻链再次多样化以实现针对第二 靶（VEGF或死亡受体5)的额外特异性。对于所产生的抗体之一，通过结构解析表征结合作 用，并且发现一种抗体-抗原复合物中与HER2接触的13个VH和VL⑶R残基中有11个残 基还与备选的抗体-抗原复合物中的VEGF接触。尽管公开的"二合一"抗体对HER2保持 纳摩尔亲和力，Bostrom等人（2009)公开的克隆中仅一个克隆对额外靶VEGF具有300nM的 纳摩尔亲和力，而四个其他克隆对该额外靶具有微摩尔亲和力。显而易见，这种方法已经实 现与结构上不相关的两种靶结合，这两种靶之间的表面相容性程度需要使两个重叠互补位 的特异性成为可能。尚未详细描述高度特异的这类"二合一"抗体怎样针对仅两种靶，并且 是否可以观察到这类抗体的某种总体非特异性结合作用或"粘合性"，这潜在地由需要位于 两个互补位的重叠部分中的侧链的某些构象灵活性引起。
[0015] 本领域所述的第二种方法涉及包含单结构域抗体互补对的抗体，其中所述方法允 许双特异性抗体的人为工程化，能够通过两个互补位结合结构上不相关的两种靶，所述两 个互补位均位于一个互补性异二聚VH-VL对内部并且均包含属于这个互补性VH-VL对的 CDR残基。WO 2003/002609和US 2007/026482已经描述了异二聚VH-VL抗体，其中重链可 变结构域识别一种靶并且轻链可变结构域识别结构上不相关的第二靶，并且其中具有不同 特异性的两个单结构域合并成一个联合异二聚VH-VL可变区。在这类抗体的已公开例子 中，首先将单结构域分别作为非配对VH结构域或作为非配对VL结构域选择以结合两种不 相关的靶，并且此后合并成对两种靶特异的联合异二聚VH-VL可变区。
[0016] 对属于第一类双特异性抗体（所述双特异性抗体能够通过两个互补位结合两种 靶，两个互补位均位于一个互补性异二聚VH-VL对内部并且均包含属于这个互补性VH-VL 对的CDR残基）的全部分子而言，不需要额外的结构域或实体与IgG分子融合，不需要IgG 分子的结构性环多样化并且不需要利用限制性异质双特异性Fc区来实现双特异性。这个 具有几种潜在的益处：
[0017] 降低了减少蛋白质稳定性的风险，原因是不必将结构性环多样化并不必修饰恒定 结构域界面，从而产生潜在地大大改善的抗体生物物理特性。
[0018] 不需要潜在地易遭蛋白酶解或潜在地有免疫原性的接头，这导致抗体作为活性药 物成分的可发展性改进。
[0019] 不可能出现VH结构域和VL结构域的不希望有的配对，从而在表达期间避免包含 错配的异二聚VH-VL可变区的潜在副产物，因为仅需要一个独特VH区和一个独特VL区。
[0020] 因为与常规的单特异性抗体相比，不需要额外的二硫键，所以预计表达不减少或 不形成异常共价聚集物。
[0021] 在一个互补性异二聚VH-VL对内部包含两个互补位的双特异性异二聚可变区可 以与不同恒定结构域（包括Fc区）组合。这提供几个优点： a. 使用充分建立的方法，例如与制造常规单特异性IgG中使用的那些方法相同的方 法，潜在地改善制造。 b. 患者和动物模型中调节FcRn介导的血清半寿期。 c. 无需选择与不同同种型相关的效应子功能，范围从无细胞毒性、基本上惰性表现 (例如在设计用于阻断受体的抗体中）至侵入的细胞毒表现（例如在设计成杀伤肿瘤细胞 的抗体中）。
[0022] 通过与交叉反应性工程化相关的方法衍生的"二合一"抗体的以上第三例子在其 医学适用性方面潜在地大为受限于两种不相关的靶竞争CDR环内部重叠性残基、至少部分 共有的结合残基。另外，在首先实现对一种靶的特异性、随后再次多样化并且随后找到对额 外靶特异的克隆时，"二合一"抗体的内在依次选择过程是耗时和不可预测的，因为仅有限 数目对第一靶特异的抗体可以再次多样化成可选择的文库，但是不知道哪种第一特异性克 隆将对预工程化额外的所需特异性可操作。最后，"二合一"抗体的分离和亲和力成熟因以 下事实而严重复杂化：对可变结构域序列旨在增加与一种靶结合的任何改善可能潜在引起 对另一种靶的亲和力降低。
[0023] 通过轻链⑶R环残基结合一种靶并通过重链⑶R环残基结合另一种靶的以上第 四例子因以下事实而严重复杂化：一些潜在重要的负责与第一靶结合的轻链CDR残基在最 终、包装的双特异性异二聚抗体可变区中与一些潜在重要的负责与第二靶结合的重链CDR 残基直接