抗ctla-4和pd-1的双重可变结构域免疫球蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及了抗CTLA-4和PD-1抗体双重可变结构域免 疫球蛋白（dualvari油ledomainimmunoglobulin，DVD-Ig)的构建、筛选、制备方法及其 潜在的在肿瘤治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 免疫检查点（immunecheckpoint)是免疫系统中存在的一些抑制性信号通路，通 过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐 受（Pardo11DM.Theblockadeofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy.Nat RevCancer, 2012,12(4) ;252-264.)。研究发现，肿瘤细胞正是利用免疫检查点的抑制性 信号通路抑制T淋己细胞活性，从而逃避体内免疫系统特别是T淋己细胞对肿瘤的杀伤效 应（YaoS，ZhuY，ChenL.Advancesintargetingcellsurfacesignalingmolecules forimmunemodulation.P'JatRevDrugDiscov，2013,12(2) ; 130-146.)。重要的免疫检 查点（immunecheckpoint)分子主要有CTLA-4、PD-1、VISTA(Wang,Letal..VISTA,a novelmouseIgsuperfamilyligandthatnegativelyregulatesTcellresponses. J.Exp.Med. 2011208,577-592)、LAG-3(Triebel，Fetal. (LAG_3，anovellympho巧te activationgenecloselyrelatedtoCD4.J.Exp.Med. 1990，. 171,1393-1405.)和 TIM-3(Sakuishietal.TargetingTim-3andPD-1pathwaystoreverseTcell exhaustionandrestoreanti-tumorimmunity.J.Exp.Med. 2010207, 2187-2194.)等。
[0003] 细胞毒性T细胞相关抗原4 (CTLA-4/CD152)和CD28同为免疫球蛋白超基因家族 成员，二者具有70 %的同源性，均为表达于T细胞表面的跨膜受体。CD28和CTLA-4是一对 具有正负调节功能的重要共刺激分子，二者竞争性结合B7分子，但CTLA4与其配体亲和力 较CD28大20倍。CD28与APC上的B7-1和B7-2的结合后能够传递共刺激信号给T淋己 细胞，增强CD3/TCR复合体或CD2分子的作用，诱导T淋己细胞活化和分泌多种细胞因子。 CTLA-4则抑制T淋己细胞的增殖、活化，诱导活化的T淋己细胞调亡，二者是机体免疫系统 维持的关键环节。
[0004] 程序性死亡蛋白-1(programmeddeath-1，PD-1)则是T细胞表面另一个重要的 抑制性受体，与CD28和CTLA-4具有同源性，可诱导性地表达于活化的T细胞、B细胞、巨瞻 细胞、树突状细胞W及单核细胞，在静息的淋己细胞表面无表达。其配体为B7-同源分子 l(B7-homolog1，B7-H1)和B7DC。B7-H1 也称程序性死亡蛋白配体-1(programmeddeath ligand-l，PD-Ll)。活化的淋己细胞表面PD-1的表达上调能够导致获得性或者固有免疫反 应的抑制。PD-1/PD-L1的结合对于调节T淋己细胞激活和维持外周免疫耐受发挥重要作 用。许多肿瘤细胞表面存在PD-1和或PD-L1的高表达，肿瘤细胞正是利用该一重要机制抑 制T淋己细胞活性，达到逃避免疫系统对其攻击。
[0005] 2013年《Science》杂志将肿瘤免疫治疗列为2013年十大科学突破的首位。CTLA-4 为免疫检查点分子之一，目前已有它的两种免疫融合蛋白上市，分别是Abatacept(2005年 上市）和Belatacept(2011年上市），前者为普通的CTLA-4融合蛋白，后者是对CTLA-4进 行了突变，提高其对配体的亲和力，分别用于自身免疫性疾病和肾移植排异反应的治疗。 CTLA-4抗体药物Ipilimumab(商品名YERVOY?.)为全人源IgGl抗体分子，Ipilimumab 不直接杀伤肿瘤细胞，其与CTLA-4结合后抑制CTLA-4的功能，解除抗原特异性T淋己细 胞的免疫耐受和TCR信号的直接抑制作用，提高IL-2的表达，从而提高T效应细胞功能， 降低Treg细胞对患者免疫系统的抑制。2011年被FDA批准用于黑色素瘤的治疗。临床研 究结果显示Ipilimum油用于晚期黑色素瘤患者，能够引发持续的免疫反应，客观缓解率为 10 %~15 %，并能有效的延长患者的生存。PD-1/PD-L1通路抗体主要包括抗PD-1和PD-L1 单抗，也有针对PD-L2的产品。抗PD-1抗体研究比较成熟的有BMS的Nivolum油和Merck 的Lambrolizumab任embrolizumab)。Nivolumab(商品名OPDIVO?.)为全人源IgG4 抗体 分子，Lambrolizum油（商品名KEYTRUDA? )为人源化IgG4抗体分子。它们与PD-1结 合后抑制其与配体PD-L1和PD-L2的结合，促进T淋己细胞增殖和细胞因子产生，解除PD-1 系统对肿瘤活性T淋己细胞免疫监视的抑制。2008年至2012年Nivolum油治疗107例晚 期黑色素瘤的临床研究，结果显示，难治性晚期黑色素瘤患者接受Nivolum油治疗后，其总 生存期接近17个月。停药后肿瘤缓解可维持较长时间，并且安全性高。特别值得关注的是， 该些患者中有62%的患者之前接受了 2至5疗程的全身性治疗，属于难治性晚期患者。33 例患者（31%)获得肿瘤的客观缓解。在一项3期临床头对头比较化divo和多西他赛治疗 之前接受过治疗的，鱗状晚期非小细胞肺癌的疗效和安全性研究中，患者被随机分配接受 每2周静脉内注射3mg/kg的Nivolum油治疗（n= 135)，或每3周静脉内注射75mg/m2的 多西他赛治疗（n= 137)。与多西他赛组相比，Nivolumab组的0S改善更加显著，且有统计 学差异。Nivolum油组患者的中位0S为9. 2个月（95%CI;7. 3,13. 3)，多西他赛组为6个 月（95%CI;5. 1,7. 3)。Nivolumab对鱗性NSCLC的有效性在一项纳入了 117例鱗性非小细 胞肺癌的单臂试验中得到了进一步证实。该研究的参与者均为在经历了W销为基础的治疗 及至少另一项系统性治疗方案后发生了疾病进展。15%的患者产生了总缓解，其中59%的 患者的缓解时间长达6个月或更久。化divo治疗黑色素瘤和非小细胞肺癌分别于2014年 9月和2015年3月获批上市。Lambrolizumab(MK-3475)获得了FDA突破性药物资格，2014 年9月治疗黑色素瘤获批，目前MK-3475的临床项目包括横跨30种不同肿瘤类型、超过24 项临床试验，其中包括4项新的III期研究。
[0006]CTLA-4和PD-1均为T淋己细胞活化抑制受体，可阻断T淋己的活化，但二者阻 断的机制完全不同。CTLA-4介导的抑制效应表现为抑制Akt的磯酸化，而PD-1介导的抑 制Akt的磯酸化效应为阻碍由CD28介导的磯脂酷肌醇3-激酶（PI3K)的激活，PD-1抑 制PI3K/Akt激活的能力依赖于位于细胞质的免疫受体酪氨酸激酶转换基序，PD-1对CD3/ CD28 的抑制效应比较有效（ParryRVetal.CTLA-4andPD-1receptorsinhibitT-cell activationbydistinctmechanisms.MolCellBiol2005;25:9543-53. )。CTLA-4 在免 疫反应的早期就会产生作用，它受到区域淋己结抗原提呈细胞W及未处理T细胞水平的影 响。PD-1表达在激活型T细胞表面的，PD-l/PDkl在效应T细胞发挥作用时是处于外周组 织当中。CTLA-4和PD-1都可W通过抑制性抗体来加强T细胞的活化和肿瘤的免疫活性， 从而成为有效的肿瘤治疗药物。由于CTLA-4和PD-1作用于免疫细胞激活的不同阶段，所 W该两个药物可被用在不同的人群，甚至可W联用。抗CTLA-4和抗PD-1抗体在抑制肿瘤 生长的免疫效应中中发挥互补和协同作用。在临床前B16黑色素瘤肿瘤模型研究中，将抗 CTLA-4和抗PD-1抗体联合应用导致肿瘤组织中T效应细胞的浸润，肿瘤组织中T效应细胞 (Teff)比T调节细胞（Treg)比例升高，抑制肿瘤的效应高于单独使用抗CTLA-4或抗PD-1 抗体。抗CTLA-4和抗PD-1抗体的协同效应也表现在T效应细胞（Teff)比髓源性抑制细 胞比例升高。IFN-丫表达也上升。百时美施贵宝炬艦)2015年4月公布了免疫组合疗法 化divo巧ervoy用于黑色素瘤一线治疗临床II期的积极数据。与化rvoy单药疗法相比， 化divo巧ervoy组合疗法取得了非常高的客观缓解率（61 %VS11 % )，完全缓解率22 %，疾 病恶化或死亡风险降低60%。针对BRAF突变型黑色素瘤，化divo巧ervoy方案也取得了相 似的结果，中位无进展生存期（PFS;8. 5个月vs2. 7个月），疾病恶化或死亡风险降低60%。 此外，客观缓解率（0RR)独立于PD-L1状态；PD-L1阳性肿瘤中0RR为58%，PD-L1阴性肿 瘤中0RR为55%。
[0007]双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，是基因工程抗体的一 种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。制备方法 包括；化学偶联法，杂交-杂交瘤法，基因