一种镍-IgM螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测领域，更具体地说，设及一种镶-IgM馨合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 血清中IgM是由5个单体通过一个J链和二硫键连接成五聚体，分子量最大，为 970kD，沉降系数为19S，称为巨球蛋白（maNioglobulin)。在分子结构上IgM无较链区，Cy2 可能替代了较链区的功能。在生物进化过程中IgM是最早出现的免疫球蛋白。在个体发育 过程中，无论是B细胞膜表面Ig(Smig)，还是合成分泌到血清中的Ig，IgM都是最早出现的 Ig，在胚胎发育晚期的胎儿即有能力产生IgM。在抗原刺激诱导体液免疫应答过程中，一般 IgM也最先产生。IgM占血清总Ig的5%~10%。由于IgM在免疫应答早期产生，并在补体 参与下的溶血作用比IgG强500倍W上，而且活化补体后通过C3b、C4b等片段发挥调理作 用，因此IgM在机体的早期免疫防护中占有重要地位。天然的血型抗体（凝集素）为IgM， 血型不符的输血，易发生严重的溶血反应。IgM不能过胎盘，厮血中如出现针对某种病原微 生物的IgM,表示胚胎期有相应病原微生物如梅毒螺旋体、风疹或巨细胞毒等感染，称为胚 胎感染或垂直感染。正常人血清中也含有产量单体IgM。
[0003] 镶作为一种常见的有毒金属，广泛应用于生活、生产之中，包括生产硬币、珠宝、镶 合金不诱钢、制造Ni-Cd电池等，与人们的生活息息相关。随着科技的进步，人们将镶作为 催化剂用于生产碳纳米颗粒的生产之中，又进一步加深了镶对于人类的影响。对于普通人 群，镶主要是通过食入、饮入、接触等方式摄入镶，当然吸烟也是一重要途径。研究发现，过 量的镶会导致机体多处组织及器官损伤，导致多种疾病的发生，包括呼吸系统疾病（肺炎、 支气管炎、肺纤维化、哮喘、肺水肿等）、屯、血管疾病、肾脏疾病、皮肤疾病等，甚至还会导致 肿瘤的发生。
[0004] 流行病学资料显示，长期接触镶的工人，其患呼吸系统肿瘤的几率大大增加，并且 其因呼吸系统肿瘤致死的几率也大大增加。动物模型、体外模型试验也发现，镶可W诱导肿 瘤的发生。1990年，国际癌症研究机构（InternationalAgencyforResearchonCancer, lARC)已将镶化合物作为第一类致癌物质佑roup1)，将金属镶作为2B类致癌物质佑roup 2B)。可见，镶严重威胁人体的健康。
[0005] 关于镶中毒，特别是慢性镶中毒的评价，仅能通过检测血镶含量，间接反应人体内 的循环镶含量，无法进一步评估镶对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术的飞速发展， 镶与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可W从机体功能角度评价镶中毒，特别是慢性 镶中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
【发明内容】
[0006] 针对镶污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种镶-IgM馨合物及其制备方 法，并建立镶-IgM馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测镶-IgM馨合物在评价一个 地区镶污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镶-IgM馨合物可W间接反映 该个地区人群受镶污染的情况，从而间接反映该个地区镶污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种镶-IgM馨合物，镶离子与 IgM通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。
[000引本发明还提供一种上述的镶-IgM馨合物的制备方法，包括W下步骤：
[0009]A)镶与IgM的馨合反应；在人源的IgM中加入镶离子进行馨合反应，得到反应溶 液；
[0010] B)纯化镶-IgM馨合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgMW及多余的镶离子，即得镶-IgM馨合物。
[0011] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下；
[0012] (1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使镶-IgM馨合物 复溶；
[001引似平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgM特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] 做上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgM与 填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.1mol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱；
[0016] 妨收集；收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0017] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0018] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与镶特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] 做上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤做中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱；
[0021] (10)收集；收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[002引 （11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得镶-IgM馨合物。
[002引其中，上述镶-IgM馨合物的制备方法，还包括步骤C);对镶-IgM馨合物的鉴定；
[0024] 其中，步骤C)中具体如下；
[0025] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0026] 似加样；取步骤B)中提取纯化得到的镶-IgM馨合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[0027] 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[002引 （4)检测；在胶床上找出含镶的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或化ISA法检测是否含有镶W及检测镶的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的镶-IgM馨合物在制备检测人体内镶-IgM馨合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的镶-IgM馨合物作为对照品的试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有可捕获IgM的蛋白或捕获金属 镶的物质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测镶-IgM馨合物的方法，W已知含量的上述的镶-IgM 馨合物作为对照品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯镶-IgM馨合物与酶联免疫结 合法、提纯镶-IgM馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯镶-IgM馨合物与电感禪合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合等离子体质谱结合法。
[0033] 实施本发明的镶-IgM馨合物及其制备方法和应用，具有W下有益效果：
[0034] 1.本发明首次体外合成或从全血中提取镶-IgM馨合物；
[0035] 2.本发明首次提出镶-IgM馨合物可用于制备检测血样中镶-IgM馨合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0036] 3.本发明建立了镶-IgM馨合物的定性定量检测方法，W便定量检测镶-IgM馨合 物在评价一个地区镶污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镶-IgM馨合物 可W间接反映该个地区人群受镶污染的情况，从而间接反映该个地区镶污染程度。本发明 建立的镶-IgM馨合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 局。
【附图说明】
[0037]图1为本发明所述的镶-IgM馨合物的非变性电泳条带图；
[003引图2为本发明所述的镶-IgM馨合物的同步福射X线电泳条带的巧光分析图；
[0039] 其中，图1中，M为Marker, 2为镶-IgM馨合物；图2中，横坐标为蛋白条带位置， 纵坐标为该蛋白条带中镶金属能量。
【具体实施方式】
[0040] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0041] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可W通过市购方式 获得：
[0042] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0043] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种；
[0044] 本发明中的所述能与IgM特异性结合的填料，为表面附有能捕获IgM的蛋白的娃 胶或树脂；
[0045] 本发明中的能捕获IgM的蛋白（抗IgM抗体），包括但不限于兔Anti-人类IgM H&L，其品牌为Abeam、型号为油8505;
[0046] 本发明中的能与镶特异性结合的填料，为表面附有能捕获铭的物质的硅胶或树 脂；
[0047] 本发明中的能捕获镶的物质，包括但不限于为鼠抗NimAb，购买自广州然科公司， 型号为服14419;
[0048] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0049] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0050]洗漆液为含有KH2PO40. 2mg/ml、化2册〇4?12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑为 7. 4 的 0. 15Mpbs溶液；
[0化1] 封闭液为1% -5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[005引 稀释缓冲液为含1. 5mg/mL化20)3、2. 93mg/mlNaHC03的PH为9.6的0. 05M磯酸 盐缓冲液；
[0053] 酶标抗体为HRP酶标抗体；
[0054] 终止液为：将21. 7ml的2M略0鹿容至200ml的d地2〇中；
[0化引洗脱液为含l-2mg/ml木瓜蛋白酶的PH为8. 0的0.Imol/LTris-肥L缓冲液；
[0056] 酸化剂为硝酸；
[0057]上样缓冲液为含有 1MTris-HCl(pH6.8) 15. 5mL、1 %漠酪藍 2. 5mL、ddH2〇7mL、甘 氨酸 25血的Samplebuffer巧)〇 ;
[0058] 电泳缓冲液为含Tris3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH为6.8的d地2〇溶液。
[0化9] 本发明提供一种镶-IgM馨合物，镶离子与IgM通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合 而成。
[0060] 本发明还提供一种镶-IgM馨合物的制备方法，包括W下步骤：
[0061] A)镶与I