一种铬-IgM螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测领域，更具体地说，设及一种铭-IgM馨合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 血清中IgM是由5个单体通过一个J链和二硫键连接成五聚体，分子量最大，为 970kD，沉降系数为19S，称为巨球蛋白（macroglobulin)。在分子结构上IgM无较链区，Cy2 可能替代了较链区的功能。在生物进化过程中IgM是最早出现的免疫球蛋白。在个体发育 过程中，无论是B细胞膜表面Ig(Smig)，还是合成分泌到血清中的Ig，IgM都是最早出现的 Ig，在胚胎发育晚期的胎儿即有能力产生IgM。在抗原刺激诱导体液免疫应答过程中，一般 IgM也最先产生。IgM占血清总Ig的5%~10%。由于IgM在免疫应答早期产生，并在补体 参与下的溶血作用比IgG强500倍W上，而且活化补体后通过C3b、C4b等片段发挥调理作 用，因此IgM在机体的早期免疫防护中占有重要地位。天然的血型抗体（凝集素）为IgM， 血型不符的输血，易发生严重的溶血反应。IgM不能过胎盘，厮血中如出现针对某种病原微 生物的IgM,表示胚胎期有相应病原微生物如梅毒螺旋体、风疹或巨细胞毒等感染，称为胚 胎感染或垂直感染。正常人血清中也含有产量单体IgM。
[000引铭（chromium,Cr)是元素周期表VI族中的一种过渡金属，其质地坚硬，表面具有 光泽，有较高的烙点，在工业生产中具有重大的经济价值，一个世纪W来被广泛应用，每年 全球铭生产量高达107吨，因而铭是一种名副其实的重要金属污染物。目前，铭广泛应用于 电锻、踩革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关，但是同样也对人 类的身体健康产生巨大影响。在美国，化与化、(M、化被称为四大环境污染物。据统计，每 年有几十个亿的民众都在饮用铭污染的水源，而在加利福利亚有高达30%的水资源都已经 被铭污染，因而铭污染严重影响着人们的身体健康。
[0004] 自然界中铭主要价和六价的形式存在，而一般认为，=价铭是人类所需的微 量元素，而六价铭才是明显的毒性物质。由于六价铭易通过细胞膜进入细胞，而且可W通过 一系列反应，产生强烈的细胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铭的毒性高于=价铭，达 10-100倍。学者认为当水中的六价铭含量超过0.05mg/L即是有毒的。六价铭可W通过皮 肤接触、食物摄入、饮用水饮入、呼吸道吸入等途径进入人体，对于职业性暴露人群主要是 通过呼吸道吸入六价铭灰尘，而对于普通人群则是通过饮入污染水源、食入被污染的食物、 吸入等方式摄入六价铭。六价铭进入体内后，可W引发氧化应激、染色体崎变、细胞调亡、多 种DNA损伤（包括单链断裂、DNA-蛋白质交联、DNA-氨基酸交联Xr-DNA配合物形成等），从 而造成机体多处组织、器官、系统损伤。不仅如此，六价铭还被认为是一种强有力的致癌物， 早在 1990 年国际癌症研究组织（InternationalAgencyforResearchonCancer,IARC) 就将六价铭作为一种人类致癌物。关于六价铭的细胞毒性、基因毒性、致癌性已成为当前广 泛研究的课题。
[0005] 关于铭中毒，特别是慢性铭中毒的评价，仅能通过检测血铭含量，间接反应人体内 的循环铭含量，无法进一步评估铭对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术的飞速发展， 铭与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可W从机体功能角度评价铭中毒，特别是慢性 铭中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
【发明内容】
[0006] 针对铭污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铭-IgM馨合物及其制备方 法，并建立铭-IgM馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测铭-IgM馨合物在评价一个 地区铭污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铭-IgM馨合物可W间接反映 该个地区人群受铭污染的情况，从而间接反映该个地区铭污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种铭-IgM馨合物，铭离子与 IgM通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。
[000引本发明还提供一种上述的铭-IgM馨合物的制备方法，包括W下步骤：
[0009]A)铭与IgM的馨合反应；在人源的IgM中加入铭离子进行馨合反应，得到反应溶 液；
[0010] B)纯化铭-IgM聲合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgMW及多余的铭离子，即得铭-IgM馨合物。
[0011] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0012] (1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使铭-IgM馨合物 复溶；
[001引 似平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgM特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] 做上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgM与 填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱；
[0016] 妨收集；收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0017] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0018] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铭特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] 做上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤做中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱；
[0021] (10)收集；收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[002引 （11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铭-IgM馨合物。
[0023] 其中，上述铭-IgM馨合物的制备方法，还包括步骤C);对铭-IgM馨合物的鉴定；
[0024] 其中，步骤C)中具体如下；
[0025](1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0026] 似加样；取步骤B)中提取纯化得到的铭-IgM馨合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[0027] 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[002引 （4)检测；在胶床上找出含铭的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或化ISA法检测是否含有铭W及检测铭的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的铭-IgM馨合物在制备检测人体内铭-IgM馨合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的铭-IgM馨合物作为对照品的试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有可捕获IgM的蛋白或捕获金属 铭的物质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测铭-IgM馨合物的方法，W已知含量的上述的铭-IgM 馨合物作为对照品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯铭-IgM馨合物与酶联免疫结 合法、提纯铭-IgM馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯铭-IgM馨合物与电感禪合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合等离子体质谱结合法。
[0033] 实施本发明的铭-IgM馨合物及其制备方法和应用，具有W下有益效果：
[0034] 1.本发明首次体外合成铭-IgM馨合物；
[0035] 2.本发明首次提出铭-IgM馨合物可用于制备检测血样中铭-IgM馨合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0036] 3.本发明建立了铭-IgM馨合物的定性定量检测方法，W便定量检测铭-IgM馨合 物在评价一个地区铭污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铭-IgM馨合物 可W间接反映该个地区人群受铭污染的情况，从而间接反映该个地区铭污染程度。本发明 建立的铭-IgM馨合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 局。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明所述的铭-IgM馨合物的非变性电泳条带图；
[003引图2为本发明所述的铭-IgM馨合物的同步福射X线电泳条带的巧光分析图；
[0039] 其中，图1中，M为Marker, 2为铭-IgM馨合物；图2中，横坐标为蛋白条带位置， 纵坐标为该蛋白条带中铭金属能量。
【具体实施方式】
[0040] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0041] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可W通过市购方式 获得：
[0042] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0043] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种；
[0044] 本发明中的所述能与IgM特异性结合的填料，为表面附有能捕获IgM的蛋白的娃 胶或树脂；
[0045] 本发明中的能捕获IgM的蛋白（抗IgM抗体），包括但不限于兔Anti-人类IgM H&L，其品牌为Abeam、型号为油8505 ;
[0046] 本发明中的能与铭特异性结合的填料，为表面附有能捕获铭的物质的硅胶或树 脂；
[0047] 本发明中的能捕获铭的物质，包括但不限于鼠抗化mAb，购买自广州然科公司、货 号为服10641 ;
[0048] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0049] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[00加]洗漆液为含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2册〇4?1甜2〇 2.9〇mg/ml、化CIS.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑为 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0051] 封闭液为1% -5 %