一种镉-IgA螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测领域，更具体地说，设及一种簡-IgA馨合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002]IgA主要由粘膜相关淋己样组织产生，其中大部分是由胃肠淋己样组织所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜组织合成。哺乳期产妇腺组织含有大量IgA产生细胞， 该些细胞主要来自胃肠。在人类，还有少量的IgA来自骨髓。人出生后4~6月开始合成 IgA,4~12岁血清中含量达成人水平，血清型IgA总Ig的10%左右，半衰期约5~6天。 IgA有IgAl和IgA2两个亚类。IgAl主要存在于血清中，约占血清中IgA的85%，a1链分 子量为56kD;IgA2主要存在于外分泌液中，少部分W血清型IgA存在，约占血清中IgA的 15%，a2链缺乏较链区，分子量为52kD。血清中的IgA除单体形式外还有由J链共价相连 的二聚体或=聚体等形式。分泌型IgA是由J连接的双体和分泌成分所组成，主要存在于 初乳、唾液、泪液、胃肠液、支气管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型IgA通过与相应的病原微生物（如脊髓灰质炎病毒）结合，阻抑其吸附到易感细胞上，分 泌型IgA还可中和毒素如霍乱弧菌毒素和大肠杆毒素等。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染 可能与IgA合成不足有关。慢性支气管炎发作与分泌型IgA的减少也有一定关系。产妇可 通过初乳将分泌型IgA传递给婴儿，该也是一种重要的自然被动免疫。嗜酸性粒细胞、中性 粒细胞和巨瞻细胞表达化aR，血清型单体IgA可介导调理吞瞻和ADCC作用。此外，分泌 型IgA具有免疫排除功能，即分泌型IgA结合饮食中大量的可溶性抗原W及肠道正常菌群 或病原微生物所释放的热原物质，防止它们进入血液。
[0003] 簡是一种常见的有毒金属及环境污染物，广泛应用于工业生产环境中，包括电锻、 制造工业颜料、塑料稳定剂、镶铭电池等，与人们生活息息相关。对于普通人群，主要是通过 吸入簡污染的空气，及食用含簡污水灌概农田生产的农作物（如含簡大米）等方式摄入簡。 当然，吸烟也是慢性簡吸入的另一重要来源。随着经济的飞速发展，簡污染对于人类的影 响越来越大。通过研究簡对小鼠子代体液免疫的影响发现了染簡21天仔鼠的血清溶血素 滴度明显低于对照组；4周龄时高簡组、低簡组、对照组仔鼠间血清溶血素滴度没有显著差 异；8周龄时，低簡组仔鼠血清溶血素滴度与对照组相比明显升高，表现出刺激作用，而高 簡组却与对照组无显著差异，表现免疫反应受到抑制。簡对子代小鼠的免疫影响是在尚未 发生母体中毒作用的情况下产生的，对仔鼠的生长发育也未见明显影响。可见发育中的免 疫系统对簡较敏感，提示可考虑将子代免疫指标作为研究簡的发育毒性作用的指标之一。
[0004] 簡与多种蛋白质之间关系密化可W与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对簡毒性研究的深入，人们逐渐认识到簡与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解簡的毒性机理的关键所在，因此，对簡和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于簡与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与簡之 间的关系还不清楚，因而加强对于簡与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0005] 针对簡污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种簡-IgA馨合物及其制备方 法，并建立簡-IgA馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测簡-IgA馨合物在评价一个 地区簡污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中簡-IgA馨合物可W间接反映 该个地区人群受簡污染的情况，从而间接反映该个地区簡污染程度。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种簡-IgA馨合物，簡离子与 IgA通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。
[0007] 本发明还提供一种上述的簡-IgA馨合物的制备方法，包括W下步骤：
[0008]A)簡与IgA的馨合反应；在提纯源于人体的IgA或按照生物学方法重组的IgA中 加入簡离子进行馨合反应，得到反应溶液；
[0009]B)纯化簡-IgA馨合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgAW及多余的簡离子，即得簡-IgA馨合物。
[0010] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下；
[0011] (1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使簡-IgA馨合物 复溶；
[001引似平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgA特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0013] (3)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgA与 填料特异性结合；
[0014] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0015] (5)收集：收集洗脱液I ;
[0016] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0017] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与簡特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0018] (8)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤化）中样本，然后上柱；
[0019] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[0020] (10)收集；收集洗脱液II;
[002。 （11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得簡-IgA馨合物。
[0022] 其中，上述簡-IgA馨合物的制备方法，还包括步骤C);对簡-IgA馨合物的鉴定；
[0023] 其中，步骤C)中具体如下；
[0024] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[002引 似加样；取步骤B)中提取纯化得到的簡-IgA馨合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[002引 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0027] (4)检测；在胶床上找出含簡的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有簡W及检测簡的含量。
[002引本发明还提供一种如上述的簡-IgA馨合物在制备检测人体内簡-IgA馨合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0029] 本发明还提供一种至少包括如上述的簡-IgA馨合物作为标准品的试剂盒。
[0030] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获IgA的物质或捕获簡的物 质。
[0031] 本发明还提供一种定量检测簡-IgA馨合物的方法，W已知含量的上述的簡-IgA 馨合物作为标准品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯簡-IgA馨合物与酶联免疫结 合法、提纯簡-IgA馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯簡-IgA馨合物与电感禪合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合等离子体质谱结合法。
[0032] 实施本发明的簡-IgA馨合物及其制备方法和应用，具有W下有益效果：
[0033] 1.本发明首次体外合成簡-IgA馨合物；
[0034] 2.本发明首次提出簡-IgA馨合物可用于制备检测血样中簡-IgA馨合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[00巧]3.本发明建立了簡-IgA馨合物的定性定量检测方法，W便定量检测簡-IgA馨合 物在评价一个地区簡污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中簡-IgA馨合物 可W间接反映该个地区人群受簡污染的情况，从而间接反映该个地区簡污染程度。本发明 建立的簡-IgA馨合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 局。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明所述的簡-IgA馨合物的非变性电泳条带图；
[0037] 图2为本发明所述的簡-IgA馨合物的电泳条带的同步福射X线巧光分析图。
【具体实施方式】
[0038] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0039] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可W通过市购方式 获得：
[0040] 磯酸盐溶液为 0. 05-0.Imol/L化2HP04 溶液或 0. 5-lmol/L化2HP04 溶液；
[0041] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0042] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种；
[0043] 捕获IgA的物质购买自艾美捷科技有限公司的型号为Abeam油8508的兔Anti-人 类IgAH&L;其中，本发明所述与IgA特异性结合的物质、抗IgA抗体、抗IgA抗体均为捕获 IgA的物质；
[0044] 捕获簡的物质为己傲得生物科技有限公司生产的型号为AP7015的抗簡抗体；其 中，本发明所述与簡特异性结合的物质、Cd抗、抗Cd抗体、抗簡抗体均为捕获簡的物质；
[0045] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0046] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0047] 洗漆液为含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2册〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑为 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[004引封闭液为1% -5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[0049] 稀释缓冲液为含 1. 5mg/mL化2〇)3、2. 93mg/mlNaHC〇3的PH为 9.6