一种铅-IgG螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测领域，更具体地说，设及一种铅-IgG馨合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] IgG主要由脾、淋己结中的浆细胞合成和分泌，W单体形式存在。在个体发育过程 中机体合成IgG的年龄要晚于IgM，在出生后第3个月开始合成，3~5岁接近成年人水平。 IgG是血清中主要的抗体成分，约占血清总Ig的75 %。IgG是唯一能通过胎盘的Ig，在自 然被动免疫中起重要作用。此外IgG还具有调理吞瞻、ADCC和结合SPA等作用。由于IgG 上述特点，IgG在机体免疫防护中起着主要的作用，大多数抗菌、抗病毒、抗毒素抗体都属于 IgG类抗体。应用对麻疹、甲型肝炎等有免疫力的产妇或正常人丙种或胎盘球蛋白可进行人 工被动免疫，能有郊地预防相应的传染性疾病。
[0003] 铅在体内的含量超过一定水平就会对健康引起难W恢复的损害，它可W铅烟，铅 尘和各种氧化物形式被人体经呼吸道和消化道摄入体内，通过与巧离子的竞争作用，氧化 损伤，细胞调亡等机制，引起W神经、消化、造血系统障碍为主的全身性、渐进性、持久性不 可逆性疾病，而且其危害还可能遗传到下一代。贫血是铅中毒的早期症状之一，铅可抑制血 红素合成过程中许多酶的活性。铅中毒可致血管疫李、腹绞痛、视网膜小动脉疫李和高血 压，时常导致细小动脉硬化。铅的肾损害常表现为间质性肾炎或萎缩性肾炎等病变，肾小管 重吸收功能下降是早期的症状。铅接触还可能影响生殖功能，接触铅的女性发生不孕症、流 产及死胎的机率增多，并可通过胎盘转移到胎儿身上。经口铅中毒者肝脏为主要受损器官 之一，可引起肝肿大呈现黄痘，甚至肝硬变或肝坏死，肝损害可能是肝内小动脉疫李引起 局部缺血所致。铅引起化咐代谢障碍、抑制含琉基酶，干扰植物神经。
[0004] 研究发现发铅测定误差大，齿铅、骨铅及组织铅取材不易，而尿铅主要反映铅排泄 情况。2006年中国《儿童高铅血症和铅中毒预防指南》规定，儿童血铅水平的筛查可W采用 末梢血或静脉血，但诊断必须采用静脉血。但影响机体免疫球蛋白的蛋白结合铅的含量从 未有过检测。
[0005] 综合W上，关于铅中毒，特别是慢性铅中毒的评价，仅能通过检测血铅含量，间接 反应人体内的循环铅含量，无法进一步评估铅对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术 的飞速发展，铅与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可W从机体功能角度评价铅中毒， 特别是慢性铅中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
【发明内容】
[0006] 针对铅污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铅-IgG馨合物及其制备方 法，并建立铅-IgG馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测铅-IgG馨合物在评价一个 地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-IgG馨合物可W间接反映 该个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映该个地区铅污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种铅-IgG馨合物，铅离子与 IgG通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。
[0008] 本发明还提供一种上述的铅-IgG馨合物的制备方法，包括W下步骤：
[0009]A)铅与IgG的馨合反应；在人源的IgG中加入铅离子进行馨合反应，得到反应溶 液；
[0010] B)纯化铅-IgG馨合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgGW及多余的铅离子，即得铅-IgG馨合物。
[0011] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下；
[0012] (1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使铅-IgG馨合物 复溶；
[001引似平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgG特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] 做上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgG与 填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱；
[001引 妨收集；收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0017] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0018] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铅特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] (8)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤化）中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱；
[0021] (10)收集；收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[002引 （11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铅-IgG馨合物。
[0023] 其中，上述铅-IgG馨合物的制备方法，还包括步骤C);对铅-IgG馨合物的鉴定；
[0024] 其中，步骤C)中具体如下；
[0025] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[002引 似加样；取步骤B)中提取纯化得到的铅-IgG馨合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[0027] 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0028] (4)检测；在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或化ISA法检测是否含有铅W及检测铅的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的铅-IgG馨合物在制备检测人体内铅-IgG馨合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的铅-IgG馨合物作为对照品的试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有可捕获IgG的蛋白或捕获金属 铅的物质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测铅-IgG馨合物的方法，W已知含量的上述的铅-IgG 馨合物作为对照品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯铅-IgG馨合物与酶联免疫结 合法、提纯铅-IgG馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯铅-IgG馨合物与电感禪合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合等离子体质谱结合法。
[0033] 实施本发明的铅-IgG馨合物及其制备方法和应用，具有W下有益效果：
[0034] 1.本发明首次体外合成铅-IgG馨合物；
[00巧]2.本发明首次提出铅-IgG馨合物可用于制备检测血样中铅-IgG馨合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0036] 3.本发明建立了铅-IgG馨合物的定性定量检测方法，W便定量检测铅-IgG馨合 物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-IgG馨合物 可W间接反映该个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映该个地区铅污染程度。本发明 建立的铅-IgG馨合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 局。
【附图说明】
[0037]图1为本发明所述的铅-IgG馨合物的非变性电泳条带图；
[003引图2为本发明所述的铅-IgG馨合物的同步福射X线电泳条带的巧光分析图；
[0039] 其中，图1中，M为Marker, 5为铅-IgG馨合物；图2中，横坐标为蛋白条带位置， 纵坐标为该蛋白条带中铅金属能量。
【具体实施方式】
[0040] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0041] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可W通过市购方式 获得：
[0042] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0043] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种；
[0044] 本发明中的所述能与IgG特异性结合的填料，为表面附有能捕获IgG的蛋白的娃 胶或树脂；
[0045] 本发明中的能捕获IgG的蛋白（抗IgG抗体），包括但不限于兔Anti-人类IgG H&L，其品牌为Abeam、型号为油6715;
[0046] 本发明中的能与铅特异性结合的填料，为表面附有能捕获铅的物质的硅胶或树 脂；
[0047] 本发明中的能捕获铅的物质，包括但不限于鼠抗化mAb，购买自己傲德生物技术 公司炬ioWorldInc)、货号为AP7019;
[0048] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0049] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0050]洗漆液为含有KH2PO40. 2mg/ml、化2册〇4?12&0 2. 90mg/ml、化Cl8.Omg/ml、KCl 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑为 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0051] 封闭液为1% -5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[0052] 稀释缓冲液为含 1. 5mg/mL化2〇)3、2. 93mg/mlNaHC〇3的PH为 9.6的 0. 05M磯酸 盐缓冲液；
[0053] 酶标抗体为HRP酶标抗体；
[0054] 终止液为：将21. 7ml的2M&8〇4定容至200ml的d地2〇中；
[005引洗脱液为含l-2mg/ml木瓜蛋白酶的PH为8. 0的0.Imol/LTris-肥L缓冲液； [005引酸化剂为硝酸；
[0057] 上样缓冲液为含有 1MTris-HCl(pH6.8) 15. 5mL、1 %漠酪藍 2. 5mL、ddH2〇7mL、甘 氨酸 25血的Samplebuffer巧)〇 ;
[0058] 电泳缓冲液为含Tris3mg/ml、甘