一种凝胶封装的蓝细菌细胞及其封装方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化工领域和生物能源领域。具体而言是一种凝胶封装的蓝细菌细 胞及其封装方法和应用。
【背景技术】
[0002] 我国经济社会高速发展几十年来，对化石能源的需求强劲；2013年我国石油表观 消费量达到4. 98亿吨，对外依存度达58. 1%。同时，化石能源的大量使用，又造成了严重的 大气环境污染问题。我国政府已承诺到2020年单位国内生产总值二氧化碳排放比2005年 下降40%~45%，非化石能源占一次能源消费比重达到15%左右。而发展基于可再生生物质 资源的生物燃料与化学品，可以减少对传统化石能源的依赖，保障我国能源安全，同时降低 粉尘及CO 2净排放量，符合国家发展新能源、节能减排的重大战略需求。
[0003] 而基于可再生生物质生产生物燃料和化学品，就是以光合生物在细胞内积累的糖 类和脂类物质为原料，通过物理、化学或生物的方法转化为各种生物燃料和化学品。其研究 也经历了从最初以粮食作物为原料，到目前以非粮食作物为原料的发展历程。作为农业副 产物，纤维素生物质具有含量丰富和分布广泛等优势，被认为是一种非常有前景的可再生 生物质资源。但是，纤维素生物质收集运输和分解糖化等环节高能耗和高成本的问题又使 得利用纤维素生物质生产生物燃料和化学品在短期内难以产业化应用。
[0004] 由于具有生长迅速、环境适应能力强和遗传改造系统成熟等优势，蓝细菌（也称蓝 藻、蓝绿藻）经过基因工程改造后，能够在单一细胞内完成从太阳能和二氧化碳到生物燃料 和化学品的转化。通过国内外多个研究小组的努力，基因工程蓝细菌已经能够合成氢气、乙 烯、异戊二烯、乙醇、丁醇、异丁醛、异丁醇、2, 3-丁二醇、2-甲基-1 丁醇、1，2-丙二醇、脂肪 酸、脂肪醇、脂肪烃、蔗糖、乳酸和3-羟基丁酸等多种生物燃料和化学品分子（Machado and Atsumi, 2012;Robertson et al·，2011;Tan et al. , 2012;Zadran and Levine, 2012) 〇 上 述相关研究证明了基因工程蓝细菌合成生物燃料和化学品的可能性和巨大应用潜力，也引 起了国际上学术界和工业界的高度关注。不过，产品产率不高、规模化培养技术不成熟以及 由此引起的生产成本过高，又成为限制了基因工程蓝细菌合成生物燃料和化学品路线产业 化应用的主要瓶颈问题。
[0005] 为了提高蓝细菌合成产物产量和降低生产成本，除了对生产菌株进一步系统地代 谢工程改造之外，细胞培养过程的优化也必不可少。而在诸多培养优化方法中，细胞凝胶 封装（Sol-gel encapsulation)技术，能够降低分离成本和简化批次培养过程，是一种有前 景的固定培养技术。细胞凝胶封装技术是指在微生物培养之前利用琼脂、硅胶或海藻酸等 物质对细胞进行前处理，形成固态胶装基质，使得细胞被固定于基质中；固定于胶装基质中 的细胞能够从基质外的培养液中获得水、营养盐等支持生长，而细胞分泌的各种产物也能 够通过基质孔隙扩散到培养液中。在培养一段时间之后，通过简单的过滤等方法，即可将固 定于凝胶内的细胞与其分泌的产物分离；而且通过向胶装基质中再次添加培养液又能够实 现批次培养。
[0006] 到目前为止，只有少量关于凝胶封装技术应用于蓝细菌培养的研究被报道。英 国邓迪大学的一个研究小组，利用海藻酸溶液封装聚球藻（Synechococcus) PCC6714和 PCC6311细胞，并研究了封装后的细胞在低渗胁迫时向胞外分泌相容性物质--甘油葡萄 糖苷和自由氨基酸的现象（Reed et al.，1986)。而德国罗斯托克大学的Erdmann N.课题组 报道了他们利用琼脂封装技术对聚球藻PCC7942和坚实微囊藻(Microcystis firma)细胞 进行了固定，并分别研究了在不同盐浓度胁迫下蔗糖和甘油葡萄糖苷的合成情况（Erdmann et al.，1992)。除了海藻酸和琼脂胶封装之外，研究最多的蓝细菌细胞凝胶封装技术就是 硅胶封装（Silica sol-gel encapsulation)技术。比利时Namur大学一个研究小组详细 研究了不同硅胶前体和其他固定条件对聚球藻PCC6301，7002和7418细胞各种生理活动的 影响（Rooke et al.，2008)。而美国俄勒R大学Roger L. Ely课题组筛选得到了对集胞藻 PCC6803产氢气最佳的硅胶封装条件，发现在这种条件下集胞藻PCC6803氢气产量高于液 体培养的细胞（Dickson et al.，2009);也系统研究了硅胶封装对集胞藻PCC6803转录组 的影响（Dickson et al·，2012)以及硅胶封装条件下可溶性离子的扩散情况（Dickson et al.，2013)。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种凝胶封装的蓝细菌细胞及其封装方法和应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0009] -种凝胶封装的蓝细菌细胞，凝胶封装的蓝细菌细胞包括能够水合形成凝胶的物 质和被封装的蓝细菌细胞。
[0010] 所述的能够水合形成凝胶的物质为琼脂（Agar)、海藻酸钠、富含硅的溶液(如水合 的硅酸钠溶液）或醇盐(Alkoxide)前体。
[0011] 所述的蓝细菌为集胞藻（Synechocystis sp. )PCC6803、聚球藻（Synechococcus) PCC7002、聚球藻（Synechococcus elongatus sp. )PCC7942、鱼渥藻（Anabaena sp.) PCC7120、嗜热聚球藻（Thermosynechococcus elongatus) BP-1 )、聚球藻 WH5701、聚球藻 CB0101、聚球藻CB0205、聚球藻RCC307、聚球藻WH7803、聚球藻RS9917、聚球藻CC9311、聚 球藻、聚球藻WH8016、聚球藻RS9916、聚球藻BL107、聚球藻CC9902、聚球藻WH8102、聚球 藻 CC9605、聚球藻 WH8109、聚球藻 PCC7335、Acaryochloris MBIC11017、Acaryochloris CCMEE5410、蓝杆藻（Cyanothece) CCYOl 10、蓝杆藻 ATCC51142、微鞘藻（Microcoleus) PCC7420、鞘丝藻（Lyngbya) PCC8106、节旋藻（Athrospira) CS-328、节旋藻 PCC8005、节旋藻 NIES-39,或上述蓝细菌菌株经过基因工程改造后能够合成生物燃料和化学品的突变菌株。
[0012] 一种凝胶封装的蓝细菌细胞的封装方法，将经培养的蓝细菌与能够水合形成凝胶 的物质混合，而后封装，即得到凝胶封装的蓝细菌细胞。其中，经培养的蓝细菌培养至细胞 OD730=4 ~5。
[0013] 一种培养蓝细菌的方法，将蓝细菌细胞封装于凝胶内，再加入活化蓝细菌的液体 培养基进行培养；或通过替换或流加营养盐的方式实现半连续或连续培养，进而获得大量 的蓝细菌分泌物。
[0014] 将所述获得的蓝细菌分泌物用于制备生物燃料或化学品中。
[0015] 所述的生物燃料和化学品为甘油葡萄糖苷、蔗糖、氢气、乙烯、异戊二烯、乙醇、丁 醇、异丁醛、异丁醇、2, 3- 丁二醇、2-甲基-1 丁醇、1，2-丙二醇、脂肪酸、脂肪醇、脂肪烃、乳 酸或3-羟基丁酸。
[0016] 本发明所具有的优点：
[0017] 本发明利用将生产各种生物燃料和化学品的蓝细菌细胞封装于凝胶内，而不是直 接在液体培养基中培养，不需离心或絮凝即可将分泌到培养基中的产物与细胞分离，有利 于批次或流式培养，能够提高单位细胞产物产量和降低生产成本。
[0018] 本发明通过琼脂凝胶封装蓝细菌细胞后，细胞仍能够生长，而且能够合成并分泌 产物；在简单过滤后更换培养基，细胞仍能在一定时间范围内保持稳定的合成并分泌产物 的能力。通过该方法培养的蓝细菌，相比于传统的液体培养方式，总的产物产量更高、能够 批次培养更多的周期，对优化培养工艺和节约成本有十分重要的意义。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例提供的在柱式光反应器培养条件下比较普通液体培养和琼 脂凝胶封装培养方式差异的照片。每张照片中，左边3个柱式光反应器采用普通液体培养 方式培养；右边3个柱式光反应器采用琼脂凝胶封装培养方式。"刚完成接种状态"，表示刚 完成接种时柱式光反应器的照片；"0-6天"，为加入600mM NaCl胁迫后第0到6天柱式光 反应器的照片。
[0020] 图2为本发明实施例提供的激光共聚焦显微镜观察被琼脂胶封装的蓝细菌细胞 形态图。蓝细菌细胞含有藻胆体，在595nm有自发荧光；利用此特点通过激光共聚焦显微镜 观察凝胶内的细胞形态。上面两张图为，扫描得到的全部照片叠加图；左上图，为刚刚被封 装在琼脂胶中的细胞；右上图为盐胁迫后第1天的细胞形态。下面两张图为，扫描得到的全 部照片三维重建得到的三维立体图像；左下图，为刚刚被封装在琼脂胶中的细胞；右下图 为盐胁迫后第1天的细胞形态。
[0021] 图3为本发明实施例提供的琼脂胶封装（Gel encapsulated)和液体培养方式 (Control) GG产量的比较图。由实施例记载，将WD094细胞分别在琼脂胶封装和液体培养 方式下培养；在盐胁迫第8天取样测试比较两种培养方式的GG产量。
[0022] 图4为本发明实施例提供的低渗胁迫和替换培养基相结合的半连续培养模式下， 液体培养(对照组，白色填充柱形图）和琼脂胶封装(实验组，灰色填充柱形图）培养条件下 分泌到胞外的甘油葡萄糖苷（GG)产量比较图。每个培养周期，对照组和实验组GG的产量 都分为培养基中的GG以及低渗释放出来的GG两部分。"总和"，指的是对照组或实验组完 成所有生长周期后GG总的产量。 具体实施例
[0023] 相关术语
[0024] 蓝细菌(也称为蓝藻）是一类光合自养的原核微生物，能够通过光合作用利用太阳 能，固定二氧化碳。基因工程改造后的蓝细菌，能够合成并分泌多种生物燃料和化学品，如 甘油葡萄糖苷、蔗糖、氢气、乙烯、异戊二烯、乙醇、丁醇、异丁醛、异丁醇、2, 3-丁二醇、2-甲 基-1 丁醇、1，2-丙二醇、脂肪酸、脂肪醇、脂肪烃、乳酸或3-羟基丁酸。
[0025] 凝胶（