专利名称：一种可产生o态和p态的细菌视紫红质薄膜的制备方法
技术领域：
本发明属于有机材料领域，特别涉及具有o态和P态的细菌视紫红质-明胶或聚乙烯醇(简称PVA)薄膜的制备。
技术背景细菌视紫红质(bateriorhodopsin， BR)是嗜盐菌紫膜中的唯一蛋白质成分。 它具有极好的稳定性和独特的光致变色性能，是目前国内外普遍认为最有希望的生物分子仿生视觉功能材料，在分子电子学和生物电子技术领域具有广泛的潜在 应用价值，可应用于全息记录、投影显示、三维光学存诸器等许多方面。细菌视 紫红质应用的基础是获得稳定的中间态，如1. Birge, R. R.; Gillespie, N. B.; Izaguirre, E. W. et al. Biomolecular Electronics: Protein-Based Associative Processors and Volumetric Memories, /尸&j. c/zem. 5 1999， 10746—10766.2. Hampp， N. Bacteriorhodopsin as a Photochromic Retinal Protein for Optical Memories, CAew.及ev. 2000, 1755—1776.3. Lanyi, J. K. Progress toward an explicit mechanistic model for the lightdriven pump, bacteriorhodopsin, FEBS Lett. 1999, 4"， 103—107.BR在存储方面的应用是以薄膜的形式加以实现的，且薄膜的质量直接影响 存储器的性能，因此BR薄膜的制备方法是目前研究中的一个重要课题，关键技术 尚处于保密阶段。 发明内容本发明的目的是提供一种能够产生O态和P态的细菌视紫红质-明胶或PVA 薄膜的制备方法，利用明胶或PVA作为聚合物载体制备可以产生O态和P态的 细菌视紫红质薄膜。一种可产生O态和P态的细菌视紫红质薄膜的制备方法，其特征是选用 分子量在30,000 ~ 70,000的分析纯明胶(或分子量在22,000 ~ 26,000的分析纯 PVA)作为高分子成膜载体，将明胶或PVA溶解于Tris(trismethylaminomethane) 或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液中得到明胶或PVA溶液，再将野生型细菌视紫红质 (BR)的悬浮液与明胶或PVA溶液充分混合，得到均匀的混合物。将此混合物铺展于石英或K7光学玻璃表面，经成膜干燥，得到表面光洁平整、BR分布均 匀、各处光密度均匀的细菌视紫红质-明胶或PVA薄膜。所述的石英或K7光学玻璃必须经表面亲水处理。方法是将清洗干净的石英 或K7光学玻璃浸泡于饱和的KOH甲醇或异丙醇溶液中，然后用二次蒸馏水冲 洗，再依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗，得到表面亲水的石英或K7光 学玻璃。所述的均匀混合物是将经超声破碎的野生型BR悬浮液与经Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲的明胶或PVA溶液以体积比为3:2 ~ 5:3的比例混合而得到的混合 液，破碎的野生型BR悬浮液碎片直径在200nm以下，BR悬浮液的浓度为10 ~ 28 mg丄"；Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液的浓度为20 ~ 50 mmohl/1;明胶或PVA 与Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液的重量/体积百分比为4 ~ 20%。由BR、 Tris或磷酸盐-拧檬酸、明胶或PVA组成的混合液体，pH值在4.0 ~ 8.5范围内。所述的成膜是将BR、 Tris或磷酸盐-柠檬酸、明胶或PVA的混合物经超声 处理，用3 5nm的滤膜过滤，除去残留的大颗粒和气泡；过滤后的混合液在 室温下静置10 30min，使细小的气泡浮于表面，将气泡刮去。将除去气泡的混 合液倒在水平放置的石英或K7光学玻璃表面铺展，在温度为4 ~ 15 'C、湿度为 40~80%的条件下，静置干燥12 48h，得到表面光洁平整、BR分布均匀、各 处光密度均匀的细菌视紫红质-明胶或PVA薄膜。本发明的最大特点是可以具有较大光密度(D = 1.0 ~ 2.5)，表面平整、BR 分散均匀的可以产生0态和P态的BR-明胶或PVA薄膜。薄膜的光密度和厚度 可以通过改变BR悬浮液和明胶或PVA-Tris (或磷酸盐-柠檬酸)溶液的用量来 调节，产生0态和P态所需的pH值通过采用pH值不同的Tris或磷酸盐-柠檬 酸缓冲液来实现。这种表面光洁平整、BR分散均匀、各处光密度均匀的BR-明胶或BR-PVA 薄膜，可以应用于空间光调制器、全息记录、模式识别和信息存储等领域，在 很大程度上拓宽了 BR材料的应用范围。
图1.本发明实施例1的薄膜照片；图2.本发明实施例3、 4中BR-明胶薄膜0态和P态的产生。
具体实施方式
本发明主要包括石英片或K7玻璃片表面的亲水化处理、明胶或PVA-Tris (或磷酸盐-柠檬酸)溶液与BR悬浮液溶液的充分混合、混合悬浮液在适当温 度和湿度条件下干燥成膜等几个步骤。 具体实施步骤为(1) 石英片或K7玻璃片表面的亲水化处理本发明人选用厚度为1 ~ 2 mm，直径20 mm,表面精度X/2的石英片或K7 玻璃片作为基底制备BR薄膜。首先将其表面处理成亲水性，以利于薄膜更好地 附着在其表面。处理过程如下a.将清洗干净的石英片或K7玻璃片放入饱和 KOH的甲醇溶液中浸泡24h; b.用二次水冲洗后，依次在丙酮、乙醇和二次水 中超声清洗15 20min;c.经过上述处理的石英片或K7玻璃片放入异丙醇中保 存备用，此时的石英片或K7玻璃片表面呈亲水性。(2) 明胶或PVA溶解于Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液选用分子量为30,000 ~ 70,000的分析纯明胶(gelatin)或分子量为22,000 ~ 26,000、醇解度为98%的分析纯PVA作为载体。将4 ~ 10 g明胶浸泡于100 mL 浓度为20 mmol丄"的Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液中溶胀24 h，然后加热到40 ~ 50 'C至明胶全部溶解，溶液变为透明，得到明胶与Tris缓冲液重量体积百分 比浓度(W/V)为4 ~ 10%的明胶-Tris或磷酸盐-柠檬酸溶液，pH值为4.0 10.0。将10 20 gPVA浸泡于100 mL浓度为50 rnmol.I/1的Tris缓冲溶液中溶胀 24 h，然后加热使其在回流下沸腾直至PVA全部溶解，溶液变为透明状，得到 PVA与Tris缓冲液重量体积百分比浓度(W/V)为10 20%的PVA-Tris溶液，pH 值为8.0。(3) BR的超声分散采用文献Oesterhelt, D.; Stoeckenius, W. 五"g;mo/., 1974, 3/, 667所报道 的方法制备野生型BR，得到浓度为10 ~ 28 mgTiiL"的BR悬浮液。为降低BR 碎片的尺寸以获得均匀的薄膜，同时减少测量时碎片对光的散射，悬浮液利用宁 波产JY92-II型超声波细胞粉碎机进行破碎处理，采用①2探头，超声功率300 Hz，超声时间1 s，间隔5 s，超声20 ~ 30次，超声过程中始终用冰水混合液冷却以 防止热量过于集中引起BR变性。经超声处理后的BR碎片直径小于200 nm。 (4 ) BR与明胶或PVA-Tris混合分别取步骤(3)中所得到的BR悬浮液0.1 0.15mL与步骤(2)中所得到 的明胶或PVA-Tris溶液0.15 ~ 0.25 mL，搅拌混合均匀。因最终获得的薄膜的光 密度取决于BR悬浮液的用量，尽量提高BR悬浮液的浓度有利于减少样品的体 积用量，明胶或PVA-Tris (或磷酸盐-柠檬酸)与BR悬浮液的体积比为3:2 ~ 5:3， 明胶或PVA-Tris (或磷酸盐-柠檬酸)的用量过多会导致薄膜的厚度增加，用量 过少则无法使BR均匀分散。(5) 混合悬浮液超声和过滤步骤(4)得到的BR与聚合物及缓冲溶液的混合物利用宁波产JY92-II型 超声波细胞粉碎机进行破碎处理，采用①2探头，超声功率200Hz，超声时间l s，间隔10s，超声20次，超声过程中始终用冰水混合液冷却以防止热量过于集 中引起BR变性。每超声5次将离心管从冰水中取出，在室温下(20~25 °C) 放置l 2min，防止明胶或PVA由于过冷而凝结，然后用3 ~ 5 pm的混合纤维 素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡等。过滤后的混合液在室 温下静置10 30min,使细小的气泡浮于表面，将气泡刮去。(6) 干燥成膜在净室中放置可调节水平的平板，调节至水平，将步骤(1)中的亲水性石 英片或K7玻璃放置于平板表面，将步骤(5)得到的混合液转移到石英片或K7 玻璃表面，令其自然铺展后，在温度为4~15 'C，相对湿度40~80%的条件下 干燥24 h。最终获得表面光洁平整、分散均匀的BR-明胶或PVA薄膜，其外观 照片见附图1。(7) 光密度及O态和P态的测量 所制备的薄膜经过测量得到如下结果薄膜具有较高的光密度，且各处的光密度均匀(见附图2)，能够产生O态和P态(见附图3)。 以明胶或聚乙烯醇为聚合物载体，薄膜的光密度对其应用也有很大影响，较大的 光密度有利于产生更高的光对比度等。本发明人对成膜的条件及过程进行了详细 研究，得到了较高光密度，表面平整、BR分散均匀、各处的光密度均匀的BR-聚合物薄膜。 实施例1选用厚度为2mm，直径20mm,表面精度X/2的石英片作为基底制备BR薄 膜。a.将清洗干净的石英片或K7玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24 h; b.用二次水冲洗后，依次在丙酮、乙醇和二次水中超声清洗15 20min; c.经 过上述处理的石英片或K7玻璃片放入异丙醇中保存备用，此时的石英片表面呈 亲水性。取经过超声处理(碎片尺寸〈200nm)、浓度为28 mg.ml/1的BR悬浮液0.15 mL与0.25 mL明胶-Tris溶液混合搅拌均匀。Tris缓冲溶液的浓度为50 mmol丄—1， 明胶与Tris缓冲液重量体积百分比浓度(W/V)为6% ，明胶-Tris与BR悬浮液的 体积比为5:3。所得的混合悬浮液利用宁波产JY92-II型超声波细胞粉碎机进行 破碎处理，(D2探头，超声功率200Hz，超声时间ls，间隔10s，超声20次， 超声过程中始终用冰水混合液冷却以防止热量过于集中引起BR变性。每超声5 次后将离心管从冰水中取出，在室温下(20~25 °C)放置2min，防止明胶由于 过冷而凝结，然后用5 ^mi的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的 大颗粒和气泡等。过滤后的混合液在室温下静置30min，使细小的气泡浮于表面， 将气泡刮去。在净室中放置可调节水平的平板，调节至水平，将亲水性石英片放置于平板 表面。另将经超声破碎的BR-明胶混合液转移到石英片表面，使其自然铺展，在 温度为4 'C，相对湿度60X的条件下干燥24h，获得表面平整、各处光密度均 匀、BR分散均匀的BR-明胶或PVA薄膜，其外观照片见附图l。 实施例2选用厚度为1 mm，直径20 mm，表面精度X/2的K7玻璃片作为基底制备 BR薄膜。a.将清洗干净的K7玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24 h; b.用二次水冲洗后，依次在丙酮、乙醇和二次水中超声清洗15 20min; c.经 过上述处理的K7玻璃片放入异丙醇中保存备用，此时的K7玻璃片表面呈亲水 性。取经过超声处理(碎片尺寸< 200 nm)、浓度为28 mg.mL—1的BR悬浮液0.15 mL与0.25 mL的PVA-Tris溶液混合搅拌均匀。Tris缓沖溶液的浓度为507mmol.i;1， PVA与Tris缓冲液重量体积百分比浓度(W/V)为15%, PVA-Tris与 BR悬浮液的体积比为5:3。所得的混合悬浮液利用宁波产JY92-II型超声波细胞 粉碎机进行破碎处理，02探头，超声功率200Hz， 超声时间1 s，间隔10s， 超声20次，超声过程中始终用冰水混合液冷却以防止热量过于集中引起BR变 性。每超声5次后将离心管从冰水中取出，在室温下(20~25 °C)放置2min， 防止PVA由于过冷而凝结，然后用5 pm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混 合液中残留的大颗粒和气泡等。过滤后的混合液在室温下静置30min，使细小的 气泡浮于表面，将气泡刮去。在净室中放置可调节水平的平板，调节至水平，将亲水性K7玻璃放置于平 板表面，另将经超声破碎的BR-PVA混合液转移到K7玻璃片表面，令其自然铺 展，在温度为4 。C,相对湿度60X的条件下干燥24h，获得表面平整、BR分散 均匀的BR- PVA薄膜。实施例3选用厚度为1 mm，直径20 mm，表面精度X/2的K7玻璃片作为基底制备 BR薄膜。a.将清洗干净的K7玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24 h; b.用二次水冲洗后，依次在丙酮、乙醇和二次水中超声清洗15 20min; c.经 过上述处理的K7玻璃片放入异丙醇中保存备用，此时的K7玻璃片表面呈亲水 性。取经过超声处理(碎片尺寸〈200nm)、浓度为10mgTnl/1的BR悬浮液0.1 mL与0.25 mL明胶-Tris溶液混合搅拌均匀。Tris缓冲溶液的浓度为20 mmo1.1/1 ， 明胶与Tris缓冲液重量体积百分比浓度(W/V)为4% ，明胶-Tris与BR悬浮液的 体积比为3:2。所得的混合悬浮液(pH = 7.2)利用宁波产JY92-II型超声波细胞 粉碎机进行破碎处理，①2探头，超声功率200Hz，超声时间ls，间隔10s，超 声20次，超声过程中始终、用冰水混合液冷却以防止热量过于集中引起BR变性。 每超声5次将离心管从冰水中取出，在室温下(20~25 'C)放置1 min，防止明 胶由于过冷而凝结，然后用5 pm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中 残留的大颗粒和气泡等。过滤后的混合液在室温下静置30min，使细小的气泡浮 于表面，将气泡刮去。节水平的平板，调节至水平，将亲水性K7玻璃放置于平 板表面，另将经超声破碎的BR-明胶混合液转移到K7玻璃片表面，令其自然铺 展，在温度为15 °C，相对湿度80X的条件下干燥24h，获得表面平整、分散均 匀的BR-明胶薄膜。实施例4选用厚度为l mm，直径20 mm，表面精度V2的K7玻璃片作为基底制备 BR薄膜。a.将清洗干净的K7玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24 h; b.用二次水冲洗后，依次在丙酮、乙醇和二次水中超声清洗15 20min; c.经 过上述处理的K7玻璃片放入异丙醇中保存备用，此时的K7玻璃片表面呈亲水 性。取经过超声处理(碎片尺寸< 200 nm)、浓度为10 mg.m!/1的BR悬浮液0.15 mL与0.25 mL明胶-磷酸盐-柠檬酸溶液混合搅拌均匀。磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液 的浓度为20 mmol.L'1，明胶与磷酸盐-拧檬酸缓冲液重量体积百分比浓度(W/V) 为4%，明胶-磷酸盐-柠檬酸与BR悬浮液的体积比为3:2。所得的混合悬浮液(pH =4.2 ~ 6.4)利用宁波产JY92-II型超声波细胞粉碎机进行破碎处理，①2探头， 超声功率200Hz，超声时间ls，间隔10s,超声20次，超声过程中始终用冰水 混合液冷却以防止热量过于集中引起BR变性。每超声5次将离心管从冰水中取 出，在室温下(20~25 °C)放置1 min，防止明胶由于过冷而凝结，然后用5 pm 的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡等。过滤后的 混合液在室温下静置30min，使细小的气泡浮于表面，将气泡刮去。在净室中放置可调节水平的平板，调节至水平，将亲水性K7玻璃放置于平 板表面，另将经超声破碎的BR-明胶混合液转移到K7玻璃片表面，令其自然铺 展，在温度为15 °C，相对湿度80X的条件下干燥24h，获得表面平整、分散均 匀的BR-明胶薄膜。
权利要求
1.一种可产生O态和P态的细菌视紫红质薄膜的制备方法，其特征是选用分子量在30,000～70,000的分析纯明胶或分子量在22,000～26,000的分析纯PVA作为高分子成膜载体，将明胶或PVA溶解于Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液中得到明胶或PVA溶液，再将野生型细菌视紫红质-BR的悬浮液与明胶或PVA溶液充分混合，得到均匀的混合物；将此混合物铺展于石英或K7光学玻璃表面，经成膜干燥，得到表面光洁平整、BR分布均匀、各处光密度均匀的细菌视紫红质-明胶或PVA薄膜。
2. 如权利要求1所述的一种可产生0态和P态的细菌视紫红质薄膜的 制备方法，其特征是所述的石英或K7光学玻璃必须经表面亲水处理，方法 是将清洗干净的石英或K7光学玻璃浸泡于饱和的KOH甲醇或异丙醇溶液 中，然后用二次蒸馏水冲洗，再依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗， 得到表面亲水的石英或K7光学玻璃。
3. 如权利要求1所述的一种可产生O态和P态的细菌视紫红质薄膜的 制备方法，其特征是所述的均匀混合物是将经超声破碎的野生型BR悬浮液 与经Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲的明胶或PVA溶液以体积比为3:2 ~ 5:3的 比例混合而得到的混合液，野生型BR悬浮液碎片直径在200 nm以下，BR 悬浮液的浓度为10 28mg七"；Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液的浓度为20 ~ 50 mmol丄"；明胶或PVA与Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液的重量/体积百 分比为4~20%。
4. 如权利要求1所述的一种可产生0态和P态的细菌视紫红质薄膜的 制备方法，其特征是所述的混合物由BR、 Tris或磷酸盐-柠檬酸、明胶或 PVA组成的混合液体，pH值在4.0 8.5范围内。
5. 如权利要求1所述的一种可产生O态和P态的细菌视紫红质薄膜的 制备方法，其特征是所述的成膜是将BR、 Tris或磷酸盐-柠檬酸、明胶或 PVA的混合物经超声处理，用3 5pm的滤膜过滤，除去残留的大颗粒和 气泡；过滤后的混合液在室温下静置10 30min，使细小的气泡浮于表面， 将气泡刮去；将除去气泡的混合液倒在水平放置的石英或K7光学玻璃表面 铺展，在温度为4 15、C、湿度为40~80%的条件下，静置干燥12 48h; 得到表面光洁平整、BR分布均匀、各处光密度均匀的细菌视紫红质-明胶 或PVA薄膜。
全文摘要
本发明属于有机材料领域，特别涉及具有O态和P态的细菌视紫红质-明胶或PVA薄膜的制备。其特征是选用分子量在30,000～70,000的分析纯明胶或分子量在22,000～26,000的分析纯PVA作为高分子成膜载体，将明胶或PVA溶解于Tris或磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液中得到明胶或PVA溶液，再将野生型细菌视紫红质—BR的悬浮液与明胶或PVA溶液充分混合，得到均匀的混合物；将此混合物铺展于石英或K7光学玻璃表面，经成膜干燥，得到表面光洁平整、BR分布均匀、各处光密度均匀的细菌视紫红质-明胶或PVA薄膜。这种表面光洁平整、BR分散均匀、各处光密度均匀的BR-明胶或BR-PVA薄膜，可以应用于空间光调制器、全息记录、模式识别和信息存储等领域。
文档编号C08L29/00GK101260241SQ20081010471
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月23日 优先权日2008年4月23日
发明者王丽萍, 许旭东, 赵成明 申请人:北京科技大学