专利名称：具有长寿命m态的化学修饰野生型细菌视紫红质－聚乙烯醇薄膜的制备方法
技术领域：
本发明属于薄膜制备领域，特别涉及利用diaza-15-crown-5作为化学添加剂制备具有长寿命M态的野生型细菌视紫红质-聚乙烯醇(BRWT-PVA)薄膜的方法。
背景技术：
细菌视紫红质(bacteriorhodopsin，BR)是一种存在于嗜盐菌紫膜中的蛋白质，它具有光致变色的特性，这使得它在新型光学信息存储材料方面有很大的应用前景。选择合适的载体，制备分散均匀的BR光学薄膜，可以实现二维信息存储，但对薄膜的质量有很高的要求，主要指标包括薄膜的厚度、均匀性、光密度等，这是因为BR薄膜的质量将会直接影响所获信息的效果，如光散射、清晰度、分辨率等。除了BR原材料因素之外，其它条件如各种添加材料、膜保护材料及采用的制膜方式等都会对薄膜的质量产生很大的影响，如1.Wu，S.；Ellerby，L.M.；Cohan，J.S.et al.Bacteriorhodopsinencapsulated in transparent sol-gel glass-a new biomaterial，Chem.Mater.1993，5，115-120；2.Birge，R.R.；Gillespie，N.B.；Izaguirre，E.W.et al.Biomolecular ElectronicsProtein-Based AssociativeProcessors and Volumetric Memories，J.Phys.Chem.B 1999，103，10746-10766；3.Hampp，N.Bacteriorhodopsin as a Photochromic RetinalProtein for Optical Memories，Chem.Rrev.2000，100，1755-1776.所报道的。
本发明人曾利用1，4，10-trioxa-7，13-diazacyclopentadecane(diaza-15-crown-5)等作为化学添加剂，将BRWT中间态M态的寿命从10ms延长到568s，延长超过4个数量级，如Bing Liang，Baofang Li，Long Jiang，Study on Long Lifetime of M-state in Chemically ModifiedBacteriorhodopsin Film，Chem.Mater.2001，13，2746-2748所报道的，这从理论上极大的拓宽了BR材料的应用范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有长寿命M态的化学修饰BRWT-PVA薄膜的制备方法，利用PVA作为聚合物载体制备得到具有长寿命M态的化学修饰BRWT薄膜，这种薄膜的表面平整、BR分散均匀，使它可以应用在空间光调制器、全息记录、模式识别和信息存储等领域，极大的拓宽了BR材料的应用范围。
本发明的技术方案是这样实现的选用分子量为22,000～26,000，醇解度为98％的分析纯聚乙烯醇(poly(vinyl alcohol)，PVA)作为载体，将它溶解在三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxylmethyl)-aminomethane，tris)缓冲液中，然后与BRWT悬浮液以及diaza-15-crown-5溶液充分混合得到一混合悬浮液，在一定的温度和湿度条件下，将混合悬浮液在亲水性的石英片或K9玻璃片表面干燥成膜，得到了薄膜表面平整、BR分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。本发明主要包括，石英片表面的亲水化处理、PVA-tris溶液与BRWT悬浮液和添加剂diaza-15-crown-5溶液的充分混合、混合悬浮液在适当温度和湿度条件下干燥成膜等几个步骤。
具体实施方法步骤为(1).基底石英片或K9玻璃片表面的亲水化处理本发明人选用石英片或K9玻璃片作为基底制备BRWT薄膜，使用的石英片或K9玻璃片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2，首先将其表面处理成亲水性，以使得薄膜可以更好的附着在其表面。处理过程如下a.将洗净的石英片或K9玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的石英片或K9玻璃片放入异丙醇中保存待用，此时的石英片或K9玻璃片表面呈亲水性。
(2).将PVA溶解于tris缓冲液中选用分子量为22,000～26,000，醇解度为98％的分析纯聚乙烯醇(PVA)作为载体，将10～15g PVA浸泡于100ml浓度为50mmol/L的Tris缓冲溶液中溶胀24小时，然后加热至沸腾(回流)，直至所有的PVA溶解，溶液变为透明，得到PVA与tris缓冲液重量体积百分比浓度(W/V)10～15％的PVA-tris溶液，溶液的pH值为8.0。
(3).BRWT分散、超声野生型BR利用文献Oesterhelt D.；Stoeckenius W.，Meth.Enzymol1974，31，667所报道的方法制备，得到浓度范围在20～28mg/ml的BRWT悬浮液，为了降低碎片的尺寸以减少测量时的光散射，悬浮液利用JY92-II型，宁波产超声波细胞粉碎机，采用Φ2探头超声破碎处理，超声功率300Hz，超声时间1s，间隔5s，超声30次，用冰水混合液冷却防止热量集中使BR蛋白变性，最终得到的碎片直径μ＜200nm；(4).BRWT+PVA-tris混合分别取步骤(3)中所得到的BRWT悬浮液0.1～0.15ml与步骤(2)中所得到的PVA-tris溶液0.15～0.25ml，搅拌混合均匀(利用旋涡混合器充分振荡混合均匀)。BRWT悬浮液的用量决定了最终薄膜的光密度，尽量提高BRWT悬浮液的浓度可以减少体积用量，PVA-tris与BRWT悬浮液的体积比为3∶2～5∶3，过多的PVA用量会导致薄膜厚度增加，太少则不能均匀分散BR。
(5).加入化学添加剂diaza-15-crown-5化学添加剂diaza-15-crown-5为分析纯，购自Acros公司，将其配成水溶液，浓度范围40～100mg/ml，在搅拌下(在旋涡混合器上振荡混合)向步骤(4)得到的混合液中逐滴加入diaza-15-crown-5溶液，这样可以避免局部添加剂过量，防止过量添加剂漂白BR蛋白，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩尔比为1∶100～1∶250(M态的寿命取决于添加剂diaza-15-crown-5的添加量，最大添加量为二者摩尔比为1∶250，具体添加量与M态寿命的关系如Bing Liang，Baofang Li，Long Jiang，Study on Long Lifetime of M-statein Chemically Modified Bacteriorhodopsin Film，Chem.Mater.2001，13，2746-2748的报道)。
(6).混合悬浮液超声、过滤步骤(5)得到的混合悬浮液pH＝8.0～8.5，混合液利用JY92-II型，宁波产超声波细胞粉碎机，采用Φ2探头超声破碎混合处理，超声功率200Hz，超声时间1s，间隔10s，共超声20次，用冰水混合液冷却防止热量集中使BR蛋白变性，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡。
(7).去除表层气泡步骤(6)得到的过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。
(8).干燥成膜在温度为2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl2溶液和相对量为20～40g变色硅胶，使干燥器内的相对湿度保持在40～50％范围内，调节里面平板的水平，将亲水性的石英片或K9玻璃片放置在平板的表面，步骤(7)得到的混合液倒在石英片或K9玻璃片表面，自然铺展后，然后在温度为2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。
(9).测光密度及M态寿命得到的薄膜具有较高光密度(见附图1)，M态的衰减时间超过40min(见附图2)，表观照片(见附图3)。
本发明中所述的石英片或K9玻璃片表面精度λ/2，λ为光的波长。
所述的用于溶解PVA的缓冲溶液是50mmol/L的tris溶液，其pH＝8.0。
所述的PVA-tris溶液的浓度为PVA与tris缓冲液重量/体积百分比(W/V)为10～15％。
所述的BRWT悬浮液浓度范围20～28mg/ml，尽可能的增大其浓度，这样可以减少所用体积。
所述的PVA-tris与BRWT悬浮液的体积比为3∶2～5∶3，过多的PVA用量会导致薄膜厚度增加，太少则不能均匀分散BRWT。
所述的添加剂diaza-15-crown-5溶液浓度范围40～100mg/ml，具体浓度用量与所需达到的添加量以及最终需要达到的光密度有关。
所述的BRWT+PVA-tris+diaza-15-crown-5混合悬浮液，其pH＝8.0～8.5。
所述的干燥器容积为5升，使用的干燥剂为50～100ml饱和MgCl2溶液和相对量为20～40g变色硅胶的组合，使用温度为2～4℃。
所述的干燥条件为温度2～4℃，相对湿度40～50％，干燥时间24小时。
以(聚乙烯醇)PVA作为聚合物载体，薄膜的光密度对其应用也有很大的影响，较大的光密度有利于产生更高的光对比度等。本发明人对成膜的条件及过程进行了研究，得到了具有较高光密度，表面平整、BR分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。
本发明的最大特点是可以得到具有长寿命M态，较大光密度(≈1.0)，表面平整、分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜，薄膜的光密度和厚度可以通过改变BRWT悬浮液和PVA-tris溶液的用量来调节。
图1.本发明实施例4化学修饰BRWT-PVA薄膜的吸收光谱；图2.本发明实施例4化学修饰BRWT-PVA薄膜M态衰减过程；图3.本发明实施例4薄膜照片。
具体实施例方式
实施例1.
选用石英片作为基底制备BR薄膜，使用的石英片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2。a.将洗净的石英片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的石英片放入异丙醇中保存待用，此时的石英片表面呈亲水性。
将经超声破碎处理(μ＜200nm)、浓度为26mg/ml的BRWT悬浮液0.15ml与0.25ml的PVA-tris溶液利用旋涡混合器充分混合均匀，tris缓冲液的浓度为50mmol/L，PVA-tris的重量体积百分比浓度为15％，PVA-tris与BRWT悬浮液的体积比为5∶3；在旋涡混合器上一边振荡混合，一边向里面逐滴加入80mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.04ml，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩尔比为1∶150，得到的混合悬浮液pH为8.2左右，超声破碎混合处理，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡，过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。在温度为2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl2溶液和20～40g变色硅胶，将混合液倒在水平石英片表面，自然铺展后，保持温度在2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。得到的薄膜具有较高光密度(见附图1)，M态的衰减时间超过15min(见附图2)，表观照片(见附图3)。
实施例2.
选用石英片作为基底制备BR薄膜，使用的石英片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2。a.将洗净的石英片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的石英片放入异丙醇中保存待用，此时的石英片表面呈亲水性。
将经超声破碎处理(μ＜200nm)、浓度为28mg/ml的BRWT悬浮液0.1ml与0.15ml的PVA-tris溶液利用旋涡混合器充分混合均匀，tris缓冲液的浓度为50mmol/L，PVA-tris的重量体积百分比浓度为10％，PVA-tris与BRWT悬浮液的体积比为3∶2；在旋涡混合器上一边振荡混合，一边向里面逐滴加入40mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.06ml，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩尔比为1∶100，得到的混合悬浮液pH为8.0左右，超声破碎混合处理，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡，过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。在温度2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl2溶液和20～40g变色硅胶，将混合液倒在水平石英片表面，自然铺展后，保持温度在2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。
实施例3.
选用K9玻璃片作为基底制备BR薄膜，使用的K9玻璃片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2，a.将洗净的K9玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的K9玻璃片放入异丙醇中保存待用，此时的K9玻璃片表面呈亲水性。
将经超声破碎处理(μ＜200nm)、浓度为20mg/ml的BRWT悬浮液0.15ml与0.25ml的PVA-tris溶液利用旋涡混合器充分混合均匀，tris缓冲液的浓度为50mmol/L，PVA-tris的重量体积百分比浓度为15％，PVA-tris与BRWT悬浮液的体积比为5∶3；在旋涡混合器上一边振荡混合，一边向里面逐滴加入100mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.05ml，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩尔数之比为1∶200，得到的混合悬浮液pH为8.3左右，超声破碎混合处理，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡，过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。在温度2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl2溶液和20～40g变色硅胶，将混合液倒在K9玻璃片表面，自然铺展后，保持温度在2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。
实施例4.
选用K9玻璃片作为基底制备BR薄膜，使用的K9玻璃片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2，a.将洗净的K9玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的K9玻璃片放入异丙醇中保存待用，此时的K9玻璃片表面呈亲水性。
将经超声破碎处理(μ＜200nm)、浓度为26mg/ml的BRWT悬浮液0.15ml与0.25ml的PVA-tris溶液利用旋涡混合器充分混合均匀，tris缓冲液的浓度为50 mmol/L，PVA-tris的重量体积百分比浓度为15％，PVA-tris与BRWT悬浮液的体积比为5∶3；在旋涡混合器上一边振荡混合，一边向里面逐滴加入100mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.08ml，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩尔数之比为1∶250，得到的混合悬浮液pH为8.5左右，超声破碎混合处理，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡，过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。在温度2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl2溶液和20～40g变色硅胶，将混合液倒在K9玻璃片表面，自然铺展后，保持温度在2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。
权利要求
1.一种具有长寿命M态的化学修饰BRWT-PVA薄膜的制备方法，其特征是选用分子量为22,000～26,000，醇解度为98％的分析纯聚乙烯醇作为载体，将它溶解在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中得到聚乙烯醇-三羟甲基氨基甲烷溶液，将聚乙烯醇-三羟甲基氨基甲烷溶液与BRWT悬浮液以及diaza-15-crown-5溶液充分混合得到一混合悬浮液，混合悬浮液在亲水性的石英片或K9玻璃片表面干燥成膜，得到了薄膜表面平整、细菌视紫红质分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的亲水性的石英片或K9玻璃片是通过将洗净的表面精度为λ/2的石英片或K9玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡后，用二次水冲洗，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗后得到的，其中λ为光的波长。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的混合悬浮液是将经超声破碎处理的BRWT悬浮液，碎片直径μ＜200nm，与聚乙烯醇-三羟甲基氨基甲烷溶液以体积比为3∶2～5∶3搅拌混合均匀得到一混合液，在搅拌下向混合液中滴加diaza-15-crown-5溶液，得到的BRWTdiaza-15-crown-5摩尔数比为1∶100～1∶250的混合悬浮液；所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度为50mmol/L；所述的聚乙烯醇-三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为聚乙烯醇与三羟甲基氨基甲烷缓冲液重量/体积百分比为10～15％；所述的BRWT悬浮液的浓度为20～28mg/ml。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征是所述的diaza-15-crown-5溶液浓度为40～100mg/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的成膜是将混合悬浮液超声破碎混合处理后，用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡；过滤后的混合悬浮液在室温条件下静置，使混合悬浮液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡；将混合悬浮液倒在石英片或K9玻璃片表面铺展，在温度为2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥，最终得到薄膜表面平整、细菌视紫红质分散均匀的化学修饰BRWT-PVA薄膜。
6.如权利要求1、3或5所述的方法，其特征是所述的BRWT+PVA-tris+diaza-15-crown-5混合悬浮液pH＝8.0～8.5。
7.如权利要求5所述的方法，其特征是所述的超声破碎混合处理是超声期间要将装有混合悬浮液的离心管从冰水中拿出，在室温条件下放置一段时间，防止由于过冷而使聚乙烯醇凝结。
8.如权利要求5所述的方法，其特征是所述的干燥使用的干燥剂为50～100ml饱和MgCl2溶液和相对量为20～40g变色硅胶的组合物。
全文摘要
本发明属于薄膜制备领域，特别涉及利用diaza－15－crown－5作为化学添加剂制备具有长寿命M态的BR
文档编号G11B7/24GK1567444SQ0313768
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月19日 优先权日2003年6月19日
发明者李宝芳, 梁冰, 张建平, 张国艳 申请人:中国科学院化学研究所