一种基于乳液pcr的测序模板的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于乳液PCR的测序模板的制备方法。
【背景技术】
[0002]PCR是一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法。乳液PCR技术利用油包水结构作为PCR反应的微反应器，进行PCR扩增，乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行PCR扩增，其关键技术是在PCR反应前，将包括PCR所有的反应成分的水溶液注入到高速旋转的油相表面，形成无数的小水滴。
[0003]利用乳液PCR的特点，在乳液制备或城中使每个微球反应液滴中只含有一个分子的测序文库和相应的扩增组分，一次来获得高效的单分子多拷贝测序模板微球，为下一步测序过程中获得更好的测序信号和数据提供了保障。基于油包水的乳液系统提出一个扩增复杂DNA混合物的方案，目标分子被分割在微小的乳液液滴中并进行分别扩增，这种方法能够在低浓度目标DNA和大量的PCR循环条件下进行。现有技术中存在几点问题，首先是乳液体系不稳定，乳液体系若不稳定，不仅降低了乳液扩增成功的几率，同时增加了试验成本，浪费了时间。其次是乳液体系液滴中，单克隆的含量比例较低，增加单克隆比例不但能提高模板的制备效率，同时也能缩短时间，降低成本。最后是磁珠的富集效率较低。所以急需建立一种新的测序模板。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是一种基于乳液PCR的测序模板的制备方法，包括以下步骤:
(1)DNA文库的获得；
(2)乳液PCR ；
(3)破乳；
(4)DNA文库微球的富集回收。
[0005]所述乳液PCR在扩增过程中，退火时间在3.5分钟以上，优选为4分钟以上。
[0006]所述破乳采用二丁醇、异丙醇和正己烷中的一种或几种。
[0007]所述乳液PCR的反应体系中包括水相、油相、引发剂、表面活性剂与助表面活性剂。
[0008]所述水相与油相的体积比为4:9-4: 7，优选为8:17。
[0009]所述油相为DC5225C、PGFE, DC193、DC556和矿物油中的I种或几种，优选为DC5225C、DC193 和 DC556。
[0010]所述引发剂为偶氮二异丁腈和硫酸亚铁。
[0011]所述表面活性剂为span80、TritonX-lOO、tween80、tween60 和 tween20 中的一种或几种，优选为span80、TritonX-100、tween80和tween60 ;在微乳液制备时，span80、tween80、tween60 和 tween20 溶于油相，TritonX-100 溶于水相。
[0012]所述表面活性剂占体系的体积比为span80 2.5-5%, TritonX-100 0.4-1.0%，tween80 0.2-0.5%，tween60 0.3-0.5%、tween20 0.2-0.8% ;优选为 span80 2.5-3.5%，TritonX-100 0.7-0.9%, tween80 0.3-0.4%, tween60 0.4-0.5%和 tween20 0.4-0.7%o
[0013]所述助表面活性剂为聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一种或几种。
[0014]所述水相中包括emPCR助剂、扩增液、引物、DNA聚合酶、dNTP、PPiase (肽脯氨酰顺反异构酶)、!\%(312和水；所述emPCR助剂包括betaine(甜菜碱)、D_ (+) trehalose(右旋海藻糖)、L_carnitine (左旋肉碱)、NP_40 (乙基苯基聚乙二醇)、DTT( 二硫苏糖醇)、formamide(甲酰胺)和DMSO( 二甲基亚砜)中的一种或几种，优选为betaine、D-(+) trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT、formamide 和 DMSO ；占体系的比例为 Betaine 0.4-1.0M, D- (+)trehalose 0.2-0.5M，L-carnitine 0.1-0.4M，NP-40 0.2-0.6%，DTT 1-2.5mM, formamide
0.l-0.2%，DMSO 1-2.5% (其中的百分含量为体积比)。
[0015]本发明的制备方法操作简单，非常有利于大规模应用。有以下优点:使用的油相、水相表面活性剂以及助表面活性剂使配制的乳液体系非常稳定，乳液扩增的效率高，错配率低，提高了乳液扩增的成功率，降低了实验成本，节省了人力物力成本。乳液体系中，液滴的单克隆比例含量高，单克隆比例的增加显著了提高了乳液扩增的效率。同时，磁性微球的富集效率高。引发剂的选择进一步改善了乳液的乳化效果。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
1.DNA文库的获得
(1)对基因组DNA进行片段化，连接接头，处理后得到单链DNA文库；
(2)将清洗后的微球分装至2mlEP管中；
(3)在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μ L，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
[0017]2.乳液 PCR
(I)配制油相，混合 DC5225C 550 yL、DC193 500 μ L 和 DC556 1200 μ L0
[0018](2)配制水相，加入 1x扩增液100 μ L 10μΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L PPiase 2 μ L MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L 双蒸无菌水余量总计 100uL
其中，emPCR 助剂为 Betaine 0.4M，D- (+) trehalose 0.5M，L-carnitine 0.1M，NP-40
0.2%，DTT 2.5mM，DMSO 1%。
[0019](3)按占体系的体积比，将 span80 2.5%，tween80 0.4%、tween20 0.7% 和聚乙二醇0.4%。溶于油相，TritonX-1OO 0.4%溶于水相，混合。
[0020](4)加入文库混合液、偶氮二异丁腈和硫酸亚铁，置于TissueLyser进行乳化。
[0021](5) PCR 扩增。
[0022]3.破乳
(I)采用二丁醇和正己烷破乳。
[0023]4.DNA文库微球的富集回收
(I)微球富集准备
a)微球悬液离心弃上清，加入0.15M NaOH振荡混匀，室温孵育3min。
[0024]b)离心弃上清，用500μ1退火缓冲液离心清洗两次。
[0025]c)用30μ1退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75μ1，振荡混匀。
[0026]d)退火:53°C孵育5min后迅速置于冰上2min。
[0027]e)用500μ1磷酸盐缓冲液离心清洗两次，500μ1磷酸盐缓冲液重悬。
[0028](2)微球富集
a)取微球20μ1，磁力架吸附2min，弃上清。
[0029]b)用500μ1磷酸盐缓冲液磁力架清洗两次，使用NaCl溶液清洗微球。
[0030]c)使用20μ1磷酸盐缓冲液重悬，振荡混匀后室温离心5min。
[0031]d)置于磁力架上2min，观察。
[0032]实施例2
1.DNA文库的获得
(1)使用CaptureBead Wash Buffer TW对磁性微球祸旋震荡，重复两次，5000rpm离心，除去上清；
(2)将清洗后的微球分装至2mlEP管中；
(3)在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μ L，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
[0033]2.乳液 PCR
(I)配制油相，混合 PGPE 450 yL 和 DC556 1300 μ L0
[0034](2)配制水相，加入 1x扩增液100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L PPiase 2 μ L MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L 双蒸无菌水余量总计 100yL
其中，emPCR 助剂为 Betaine 1.0M, D- (+) trehalose 0.2M，L-carnitine 0.4M，NP-400.6%，DTT ImM，DMSO 2.5%。
[0035](3)将 span80 3.5%，tween80 0.3%、tween60 0.4% 和丙三醇 0.35%。溶于油相，TritonX-100 0.7%溶于水相，混合。
[0036](4)加入文库混合液、偶氮二异丁腈和硫酸亚铁，置于TissueLyser进行乳化。
[0037](5) PCR 扩增。
[0038]3.破乳
(O收集乳化液，使用正己烷破乳。
[0039]4.DNA文库微球的富集回收 (I)微球富集准备
a)微球悬液离心弃上清，加入0.1M NaOH振荡混匀，室温孵育3min。
[0040]b)离心弃上清，用500μ1退火缓冲液离心清洗两次。
[0041]c)用30μ1退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75μ1，振荡混匀。
[0042]d)退火:53°C孵育6min后迅速置于冰上2min。
[0043]e)用500μ1磷酸盐缓冲液离心清洗两次，500μ1磷酸盐缓冲液重悬。
[0044](2)微球富集
a)取微球20μ1，磁力架吸附2min，弃上清。
[0045]b)用500μ1磷酸盐缓冲液磁力架清洗两次，使用盐溶液清洗微球。
[0046]c)使用20μ1磷酸盐缓冲液重悬，振荡混匀后室温离心5min。
[0047]d)置于磁力架上2min，观察。
[0048]实施例3
1.DNA文库的获得
(1)对基因组DNA进行片段化，连接接头，处理后得到单链DNA文库；
(2)将清洗后的微球分装至2mlEP管中；
(3)在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μ L，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
[0049]2.乳液 PCR
(I)配制油相，混合 DC5225C 300 μ L,PGFE 200 yL、DC193 800 yL、DC556 300 μ L 和矿物油400 μ Lo
[0050](2)配制水相，加入 1x扩增液100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L PPiase 2 μ L MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L 双蒸无菌水余量总计 100yL
其中，e