一种青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法，包括以下步骤:（1）绵羊线粒体Cytb全序列的收集及与近缘线粒体Cytb序列的比对；（2）引物设计与PCR扩增；（3）PCR产物测序与序列组装。本发明获得了青藏高原15个藏羊地方品种642个个体的mtDNA?Cytb全序列。本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，所获得的mtDNA?Cytb全序列可应用于青藏高原藏羊遗传资源多样性评估、遗传变异分析、系统进化分析、母系起源和系统发育研究及种质资源鉴定与保护等领域。
【专利说明】—种青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法
【技术领域】
[0001]本发明属于绵羊基因组学领域,具体涉及一种青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法。
【背景技术】
[0002]家畜遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是畜牧业生产的基础。通过研究家畜的遗传多样性可以进一步了解家畜遗传多样性的丰富程度和品种遗传的独特性程度，为合理开发利用家畜遗传资源提供依据，还可以为物种多样性的保护提供依据。
[0003]绵羊的线粒体基因组DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)呈典型的闭合环状双链结构，长度为15.6kb，能够自主复制和转录。线粒体DNA(mtDNA)是核外遗传物质，具有分子量较小、进化速度快、无组织特异性及严格的母系遗传等特性，在近缘种间和种内群体间具有丰富的多态性，是研究物种起源进化、分类的有力工具。根据碱性氯化铯密度梯度离心中双链密度不同可将mtDNA的两条链分为重链(H)和轻链(L),两条链都参与复制和转录过程。对绵羊线粒体基因 组的结构分析表明，mtDNA可分为编码区和非编码区。编码区内含37个基因，包括13个蛋白质基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因。其中13个蛋白质编码基因分别是细胞色素b基因(Cytb)、细胞色素C氧化酶三个亚基1、II和III基因(Co I ,Co II和Co III)，ATP 合成酶亚基基因(ATPase 6 和 ATPase 8)和 7 个 NADH 酶亚基 ND 1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6和ND4L ；2个rRNA基因分别是12s rRNA基因和16s rRNA基因，紧紧相邻；线粒体的12S rRNA和16S rRNA基因位于H链的tRNA Phe和tRNA Leu基因之间，以tRNAVal基因为间隔，12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守。22个tRNA基因位于rRNA和13个蛋白质基因之间。除了 ND6和8个tRNA基因在L链编码外，其余大多数蛋白质编码基因和2个rRNA基因都是由H链编码。
[0004]Cytb是构成线粒体氧化磷酸化系统复合体III的蛋白质之一，由位于线粒体基因重链(富含G)的核昔酸编码得来，并由8个横跨膜的螺旋组成，这些螺旋与一个或二个血红素b基团结合，它是唯一由线粒体基区编码的蛋白质。Cytb在不同的氧化还原过程中有着不同的特性和功能，它是线粒体呼吸链上进行电子传递的细胞色素之一，与蛋白1、蛋白II组成复合体III的核心蛋白，该核心蛋白并没有位于复合体III的氧化还原中心，但对其中心成员的正确装配和集聚起重要作用。Cytb基因的结构和功能在mtDNA的13个蛋白质编码基因中是被了解得最为清楚的一个，它的期望分子量为42.7KD，且能用一些通用引物扩增。Cytb基因含有大约1140个碱基(1140bp)，不发生缺失和(或)插入，碱基置换多数是沉默的，且很大程度上倾向于转换或颠换，并且密码子第三位点进化最快，而密码子第二位点最保守。该基因的mRNA以一个含有4对核苷酸、5-prime的非编码区开头，紧接着是启动子AUG’末端是终止子UAA的U碱基，侧面与tRNAelu和tRNAThr相接，这些tRNA在转录过程中被剪切掉。Cytb基因含离散性性状，进化速率较快、较慢的氮基酸密码子位点并存，Cytb基因序列第三位点替换速率远大于第一、第二位点，拥有可变区与保守区，如膜内区和跨膜区，作为蛋白质编码基因有一定的保守性，同源性高。[0005] Cytb蛋白分为三个功能区:膜外区、跨膜区和膜内区。跨膜区核苷酸突变显著低于膜内和膜外区，跨膜区对功能起关键作用的氨基酸占很大比例，哺乳动物在Cytb跨膜区包括105个氨基酸残基，这些残基在多细胞动物中大约2996是完全或接近保守的，在大部分多细胞动物中功能基本相同；而位于线粒体膜内表面的膜内区有很少残基，只包含大约65个氨基酸残基，其中极性较强而保守性较弱的氨基酸残基占很大比例，这些极性氨基酸残基仍有一定程度的变异。有人推测这些氨基酸执行Ql氧化还原中心的质子输入功能，不过，大多数残基功能仍不清楚，该区的变异位点与其它两个区相比较，属中等突变率；膜外区由大约209个氨基酸残基组成，整个区域呈现明显疏水性，而且，该区的氨基酸替换多数以疏水性氨基酸为主，如亮氨酸、异亮氨酸和缘氨酸，膜外区19%的氨基酸残基在大多数细胞中接近保守，维持着该区结构稳定。Cytb蛋白是氧化还原复合体中重要的一部分，其中苯醌的氧化还原作用接触反应位点是发挥氧化还原功能最关键的部位，由辅酶Q识别两个苯醌反应接触位点，尤其是接近Q1-苯酮还原位点和Q。-对二苯酮氧化位点相连的部位，其结构极其保守，本身对一些微小的突变极度敏感，该位点稍有变异即影响呼吸功能。
[0006]藏羊主要有高原型(草地型)、山谷型和欧拉型三大类，各地根据其自然生态特点又细分为不同的类型，属粗毛型绵羊地方品种。藏羊原产于青藏高原，主要分布于西藏自治区及青海、甘肃、四川、云南、贵州等地，由于各生态条件差异悬殊，形成了不同的类型。草地型(高原型)藏羊是主体，数量最多，主要分布于西藏境内的网底斯山、念青唐古拉山以北的藏北高原和雅鲁藏布江地带；青海的藏羊主要分布在海北藏族自治州、海南藏族自治州、海西蒙古族哈萨克自治州、黄南藏族自治州、玉树藏族自治州、果洛藏族自治州六州的广阔高寒牧区；甘肃的甘南藏族自治州的各县市藏羊的主要分布区域；四川境内的藏羊分布在甘孜藏族自治州、阿坝藏族羌族自治州北部牧区。山谷型藏羊主要分布在青海省南部的班玛、囊谦两县的部分地区，四川省阿坝藏族羌族自治州南部牧区，云南的昭通市、曲靖市、丽江市及保山市腾冲县。欧拉型藏羊是藏系绵羊的一个特殊生态类型，中心产区位于甘肃省甘南藏族自治州的玛曲县欧拉乡及比邻地区及青海省河南蒙古族自治县和久治县等地。研究藏羊起源和进化可以说明古今绵羊的关系，更好的解决育种、改良、选种和保种问题。通过对藏羊遗传多样性、系统进化、母系起源的研究和认识，不但可以调查藏羊品种遗传资源背景状况，而且可确定品种遗传特征，了解各群体间的亲缘关系，准确区分品种，进而为育种工作提供重要依据。因此，有必要开展藏羊mtDNA Cytb全序列研究，从基因水平揭示其系统进化关系和种群遗传多样性水平。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提出一种速度快、成本低、易掌握的青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列及检测方法，已解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0008]为了实现上述目的，本发明的技术方案是:
一种青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法,包括以下步骤:
(1)绵羊mtDNACytb全序列的收集与分析:
收集绵羊mtDNA Cytb全序列，并与近缘种的mtDNA Cytb全序列进行比对，分析mtDNA Cytb全序列在近缘种的mtDNA全基因组序列上的相对位置；
(2)引物设计与PCR扩增:根据mtDNA Cytb基因在近缘种全基因组序列保守区域设计上、下游PCR引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知序列的未知序列，其中，所述PCR弓丨物和测序弓丨物I对，其引物序列为:
Forward primer:5， -TGAAGAAAACCCCACAAAACCT -3，
Reverse primer:5’ -TTGGGTGTTGATAGTGGGGC-3J ；
(3)PCR产物测序与序列组装:
通过PCR产物测序反应体系对PCR产物进行测序、序列分析，将mtDNA Cytb序列进行组装，获得mtDNA Cytb全序列。
[0009]步骤(1)中，所述绵羊mtDNA Cytb全序列的获得方法有三种:一种是从测序获得的基因组文库或转录组文库中查找；另一种是从GenBank数据库中公开的绵羊基因序列中查找；第三种是通过收集近缘种的mtDNA Cytb全序列进行同源比对，在保守区设计简并引物，然后以藏羊的DNA为模板进行PCR扩增，测序后获得青藏高原15个藏羊地方品种642个个体mtDNA Cytb全序列。
[0010]步骤(1)中，所述近缘种为盘羊、东方盘羊和欧洲摩弗伦羊中。
[0011]步骤(2)中，所述PCR方法中PCR扩增反应体系为30uL，包括基因组DNA模板2 uL、IOXBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA 聚合酶(λ 2 uL、3 pM 上下游引物各 3 uL、灭菌双蒸水16.8 uL ；PCR反应程序为:94°C预变性5分钟、94°C变性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36个循环、 72°C延伸10分钟，12°C保存。
[0012]步骤(3)中，所述PCR产物测序反应体系为5 uL，包括基因组DNA模板(30-50 ng)3 uL、3 pM测序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、灭菌双蒸水0.5 uL ;PCR测序反应程序为:95°C预变性120秒、95°C变性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25个循环，12°C保存。
[0013]步骤(3)中，所述PCR产物的测序方法为双向、直接测序。
[0014]步骤(3)中，所述mtDNA Cytb序列组装方法是:以盘羊、东方盘羊、欧洲摩弗伦羊的mtDNA Cytb全序列为参照物，将所有15个藏羊地方品种642个个体的mtDNA Cytb序列进行拼接，获得青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列,所述青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列长度均为1140bp。
[0015]综上所述，本发明有益效果:
1、本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，能够有效检测出青藏高原藏羊的mtDNA Cytb全序列，从而为青藏高原藏羊分子遗传学及分子系统进化学研究提供有效的研究平台。
[0016]2、本发明提供的青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列可应用于藏羊遗传资源多样性评估、遗传变异分析、系统进化分析、母系起源和系统发育研究及种质资源鉴定与保护等领域。
【具体实施方式】
[0017]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0018]实施例1
一种青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法,包括以下步骤:
(1)绵羊mtDNACytb全序列的收集与分析
首先，本发明从测序获得的基因组文库中筛选青藏高原藏羊mtDNA Cytb相关基因序列，一方面从GenBank数据库中检索青藏高原藏羊mtDNA Cytb相关基因；然后，将收集到的青藏高原藏羊mtDNA Cytb相关基因序列与近缘种盘羊、东方盘羊、欧洲摩弗伦羊的mtDNA Cytb全序列进行比对,分析相关基因在近缘种mtDNA Cytb全序列上的相对位置；
(2)引物设计与PCR扩增
根据藏羊mtDNA Cytb全序列在近缘种基因组序列上的相对位置，以藏羊基因组为模板设计引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知基因间的未知序列；PCR扩增反应体系为30uL，包括基因组DNA模板 2 uLUO XBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA聚合酶0.2uL、3 pM上下游引物各3 uL、灭菌双蒸水16.8 uL ;PCR反应程序为:94°C预变性5分钟、94°C变性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36个循环、72°C延伸10分钟，最后12°C保存；PCR反应完成后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的质量；
(3)PCR 产物测序与序列组装
PCR产物测序反应体系为5 uL，包括基因组DNA模板(30-50 ng) 3 uL、3 pM测序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、灭菌双蒸水0.5 uL ;PCR测序反应程序为:95°C预变性120秒、95°C变性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25个循环，12°C保存。
[0019]将上述PCR产物送测序公司进行双向、直接测序。将每个PCR产物的双向测序结果拼接为一条完整的序列。然后以盘羊、东方盘羊、欧洲摩弗伦羊的mtDNA Cytb全序列为参照序列，将所有的mtDNA基因进行组装。最后组装获得藏羊15个地方绵羊品种642个个体mtDNA Cytb全序列。
[0020]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0021]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1.一种青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法,其特征是,包括以下步骤: (1)绵羊mtDNACytb全序列的收集与分析: 收集绵羊mtDNA Cytb全序列，并与近缘种的mtDNA Cytb全序列进行比对，分析mtDNA Cytb全序列在近缘种的mtDNA全基因组序列上的相对位置； (2)引物设计与PCR扩增: 根据mtDNA Cytb基因在近缘种全基因组序列保守区域设计上、下游PCR引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知序列的未知序列，其中，PCR引物和测序弓丨物I对，其引物序列为:
Forward primer:5，-TGAAGAAAACCCCACAAAACCT -3，
Reverse primer:5’ -TTGGGTGTTGATAGTGGGGC-3’ ； (3)PCR产物测序与序列组装: 通过PCR产物测序反应体系对PCR产物进行测序、序列分析，将mtDNA Cytb序列进行组装，获得mtDNA Cytb全序列。
2.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步骤(1)中，所述绵羊mtDNA Cytb全序列的获得方法有三种:一种是从测序获得的基因组文库或转录组文库中查找；另一种是从GenBank数据库中公开的绵羊基因序列中查找；第三种是通过收集近缘种的mtDNA Cytb全序列进行同源比对，在保守区设计简并引物，然后以藏羊的DNA为模板进行PCR扩增，测序后获得青藏高原15个藏羊地方品种642个个体mtDNA Cytb 全序列。
3.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步骤(1)中，所述近缘种为盘羊、东方盘羊和欧洲摩弗伦羊。
4.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步骤(2)中，所述PCR方法中PCR扩增反应体系为30uL，包括基因组DNA模板2 uL、IOXBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA 聚合酶(λ 2 uL、3 pM 上下游引物各 3 uL、灭菌双蒸水16.8 uL ；PCR反应程序为:94°C预变性5分钟、94°C变性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36个循环、72°C延伸10分钟；最后12°C保存。
5.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步骤(3)中，所述PCR产物测序反应体系为5 uL，包括基因组DNA模板(30-50 ng) 3 uL、3pM测序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、灭菌双蒸水0.5 uL ;PCR测序反应程序为:95°C预变性120秒、95°C变性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25个循环、12°C保存。
6.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步骤(3)中，所述PCR产物的测序方法为双向、直接测序。
7.根据权利要求1或2或3所述的一种青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法，其特征是，步骤(3)中，所述mtDNA Cytb序列组装方法是:以盘羊、东方盘羊和欧洲摩弗伦羊的mtDNA Cytb全序列为参照物，将所有15个藏羊地方品种642个个体的mtDNA Cytb序列进行拼接，获得青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列。
8.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，所述青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列长度均为1140bp。
【文档编号】C12N15/10GK103952421SQ201410187687
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】刘建斌, 孙晓萍, 王凡, 曾玉峰, 郭健, 岳耀敬, 杨博辉, 张万龙, 郎侠, 冯瑞林, 郭婷婷, 牛春娥, 王宏博 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所