一种生产灵菌红素的发酵液的方法
【专利摘要】本发明提供一种生产灵菌红素发酵液的方法，该方法以源自木本植物种子的油脂作为发酵碳源，通过控制发酵条件，从而制备出灵菌红素的含量为15-30g/L的发酵液。本发明具有的优势包括：（1）原料具有种植广泛、价格便宜、方便获得及可持续性强等优点，不会产生“与人争油，与人争地”等现象；（2）本发明采用的木本植物可以种植于荒山坡地、荒滩沼泽、前庭后院以及盐碱地等不利于粮食作物种植生产的环境，对于保护生态环境，提高土地的经济收益，保护耕地等方面也具有重要意义；（3）本发明将低价值的木本植物油脂通过发酵生成富含高附加值的医药产品灵菌红素，市场前景广阔，具有极大的开发价值。
【专利说明】一种生产灵菌红素的发酵液的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于发酵【技术领域】，具体涉及一种生产灵菌红素的发酵液的方法。
【背景技术】
[0002]灵菌红素是一个具有三吡咯环结构的红色素小分子，已被证明具有免疫抑制、抗癌、抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗霉和抗疟疾等多种生物活性。美国国立癌症研究所的研究表明，灵菌红素平均半数抑制浓度(IC5tl)为2.1 μ mol/L时，灵菌红素对人体57种不同癌细胞均具有较强的抗性，对体外肝癌转移和人原发癌细胞等多种人类癌细胞也有抗性，而对非恶性细胞系没有明显的毒性。灵菌红素因其具有癌组织的高针对性和对正常细胞则表现的低毒害作用，而成为一种非常有潜力的抗癌物质。
[0003]在灵菌红素生产方法上，早在20世纪60年代，灵菌红素化学合成的全过程就已得到详细阐述，但比较复杂和困难，难以实施。1996年，有学者提出了新的制备灵菌红素类似物的方案，先将C环和B环相连然后再和A环结合，即得到灵菌红素前体物质，但该方法不能用来合成天然的灵菌红素，因此，不能用于工业化生产灵菌红素。已经证明，采用微生物发酵方式是生成灵菌红素的经济有效的方法。
[0004]目前，已经报道的采用发酵法生产灵菌红素的碳源为大豆油、花生油、芝麻油和橄榄油等人类可食用的油脂，属于人们日常大量消费的食用油。然而，在我国，油脂加工企业每年从美国和巴西等国家进口大量大豆，并以此为原料生产大豆油，对国外依赖度大，而花生油、芝麻油和橄榄油的市场价格高。因此，采用价格相对较高的食用油脂大规模生产灵菌红素，一方面可能导致“与人争油，与人争地”的不利局面；另一方面，可能影响我国食用油脂的安全。开发和利用新型发酵碳源，替代目前广泛使用的食用油脂，大规模生产灵菌红素，对于降低灵菌红素的生产成本，提高灵菌红素的市场竞争力，替代在癌症及免疫治疗中对人体有毒害作用的化学药物，具有重要的应用价值。
[0005]目前，国际上主要以大豆油、花生油及芝麻油等为底物进行发酵，或者将禾本科油料作物种子粉碎后进行发酵，油脂的利用效率低，成本较高。由于底物性质的差异，原有的技术不适宜木本油脂发酵产灵菌红素；我国木本油料植物的开发利用还处于发展初期，目前存在的种植分散、管理落后及木本油料产量低的主要原因是木本植物油脂的开发没有受到足够的重视和支持，开发的技术水平落后，提高木本植物油脂的应用水平和附加值具有重要的经济价值和重大的社会意义。迄今为止，还未有将本发明所述木本植物油脂应用产灵菌红素的发酵液的报道。
【发明内容】
[0006]为了提高木本油料植物的开发利用，本发明提供一种生产灵菌红素的发酵液的方法。该方法以源自木本植物种子的油脂作为发酵碳源，通过控制发酵条件，从而获得高产率和高品质的灵菌红素发酵液。本发明具体的技术方案如下:
一种生产灵菌红素的发酵液的方法包括如下步骤:(1)种子培养基配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂1-2%，酵母蛋白胨1-3%,硫酸铵1_3%，磷酸二氢钾0.1-0.15%，硝酸钠0.1-0.2%，七水硫酸镁
0.01-0.05% ;pH值为7.5-9 ;配制获得种子培养基；
(2)发酵培养基配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂3-15%，酵母蛋白胨1_3%，硫酸铵1_3%，磷酸二氢钾0.1-0.2%，硝酸钠0.1-0.2%，七水硫酸镁
0.01-0.05% ;pH值为7.5-9 ;配制获得发酵培养基；
(3)灵菌红素制备:在种子培养基中，将粘质沙雷氏菌扩大培养至活细胞含量为IXlO6-2X106cfu/ml的菌液；再将菌液按质量比为2-8%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液；其中，发酵条件具体为:发酵温度28-32°C，搅拌转速200-300 rpm，通气量0.5-L0 V/V.min，罐压70-75 KPa，发酵时间30-40小时；所述灵菌红素发酵液中灵菌红素的含量为15-30g/L。
[0007]作为优化方案，种子培养基配制步骤之前还包括:
木本植物油脂的制备:取木本植物的成熟种子，将成熟种子干燥至水分含量为
5-10%，再机械粉碎至10-20目；然后对粉碎后的成熟种子进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为110-120°C，榨油机温度为80-90°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油依次经水化脱胶、中和酸性、除臭以及除色后，获得木本植物油脂。所述毛油是指压榨后初步获得的，没经过精炼加工的植物油。所述木本植物油脂中所含的脂肪酸主要包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，其中以十六碳和十八碳的脂肪酸为主，不饱和脂肪酸含量高达90%以上，木本植物油脂含单不饱和脂肪 酸和亚麻酸，在高温时化学结构仍能保持稳定。
[0008]所述木本植物为黄连木、光皮树、油桐、乌桕、山茶、文冠果或麻疯树中的一种，但不限于此，可以是其他类似品种的木本植物。
[0009]本发明相对于现有技术的有益效果在于:
(1)本发明将绝大部分被自然界中的微生物分解腐烂掉的木本植物富含油脂的种子进行了高效利用。黄连木、光皮树、油桐、乌桕、山茶、文冠果或麻疯树种植广泛，价格便宜、方便获得，不会产生“与人争油，与人争地”等现象；
(2)本发明采用的木本植物可以种植于荒山坡地、荒滩沼泽、前庭后院以及盐碱地等不利于粮食作物种植生产的环境，对于保护生态环境，提高土地的经济收益，保护耕地等方面也具有重要意义；
(3)本发明将低价值的木本植物油脂通过发酵生成富含高附加值的医药产品灵菌红素，市场前景广阔，具有极大的开发价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为从本发明的发酵液中分离出的灵菌红素的TOF-MS质谱图。(图1中纵坐标代表离子信号强度，横坐标代表离子核质比，324为分子量，325为[M+H]，通过与已有的报道以及标准品对照进行比较，证明本发明的发酵液中的红色素产物为灵菌红素)。
【具体实施方式】
[0011]下面通过实施例，对本发明作进一步地描述。
[0012]以下实施例所用原料的说明:酵母蛋白胨是市售的以高蛋白的面包酵母为原料，经自溶、酶解、分离、浓缩和干燥等工艺，制得的安全、稳定、营养全面的蛋白胨产品。所述磷酸二氢钾、硫酸铵、硝酸钠以及七水硫酸镁均为化学纯试剂，可采用国药集团化学试剂有限公司生产的上述试剂，但不限于此。所用粘质沙雷氏菌(ferraiia ?arcescefls)为中国科学院普通微生物菌种保藏中心保藏菌种。
[0013]实施例1:
木本植物油脂的制备:取黄连木的成熟种子，干燥至水分含量为5%，机械粉碎至15目；然后进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为110°C，榨油机温度为90°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油经水化脱胶、中和酸性，除臭，除色工艺，获得成品的黄连木油脂。黄连木油脂所含的脂肪酸主要包括棕榈酸、油酸、亚油酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、亚麻酸，其中油酸、亚油酸、棕榈酸含量之和占脂肪酸总量的95%左右。黄连木种仁含油率56.5%，种子出油率20%-30%，果壳含油量3.28%，是一种不干性油，油色淡黄绿色，带苦涩味。
[0014](I)种子培养基的配制:以蒸馏水为溶剂，配料及其质量比为:木本植物油脂1%，酵母蛋白胨1.5%，硫酸铵1.5%，磷酸二氢钾0.1%，硝酸钠0.1%，七水硫酸镁0.05% ;pH值为8 ;配制获得种子培养基。
[0015](2)发酵培养基的配制:以蒸馏水为溶剂，配料及其质量比为:木本植物油脂10%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵1.5%，磷酸二氢钾0.1%，硝酸钠0.2%，七水硫酸镁0.01%, pH值为8 ；配制获得发酵培养基。
[0016](3)制备灵菌红素:在种子培养基中，将粘质沙雷氏菌(Sferraiia marcescens)扩大培养至活细胞含 量为IX 106cfu/ml的菌液，将菌液按4%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液。发酵条件为:发酵温度28°C，搅拌转速200rpm，通气量0.8 V/V*min，罐压75 KPa，发酵时间30小时。
[0017]采用本实施例提供的制备方法，木本植物油脂的利用率为45%，灵菌红素的产量为30g/L。
[0018]实施例2:
木本植物油脂的制备:取光皮树的成熟种子，干燥至水分含量为8%，机械粉碎至10目；然后进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为120°C，榨油机温度为90°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油经水化脱胶、中和酸性，除臭，除色工艺，获得光皮树籽油脂，光皮树籽油脂的脂肪酸组成主要为亚油酸及油酸，所述的光皮树是一种木本油料植物，果肉和种仁均含有较多的油脂。
[0019](I)种子培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂2%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵1%，磷酸二氢钾0.1%，硝酸钠0.2%，七水硫酸镁0.05% ；pH值为7.5 ；配制获得种子培养基。
[0020](2)发酵培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂12%，酵母蛋白胨2%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾0.15%，硝酸钠0.1%，七水硫酸镁0.01% ；pH值为9 ；配制获得发酵培养基。
[0021](3)制备灵菌红素:在种子培养基中，将粘质沙雷氏菌(Serraiia marcescens)扩大培养至活细胞含量为1.5X106cfu/ml的菌液，将菌液按2%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液。发酵条件为:发酵温度28°C，搅拌转速250rpm，通气量0.5V/V.min，罐压70KPa，发酵时间35小时。
[0022]采用本实施例提供的制备方法，木本植物油脂的利用率为50%，灵菌红素的产量为25g/L。
[0023]实施例3:
木本植物油脂的制备:取油桐的成熟种子，干燥至水分含量为5%，机械粉碎至10目；然后进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为115°C，榨油机温度为85°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油经水化脱胶、中和酸性，除臭，除色工艺，获得油桐油脂。油桐油脂的折光指数为1.5206，酸化值为5.1 mg/g,碘化值为165 mg/g,阜化值为190 mg/g,透明度为透明,色泽值显示为
0.1,气味无异味,密度0.9376 g/mL,热聚合时间446秒,含β -桐酸,所述的油桐的果实约含有10粒种仁，种仁含油率约为62.89%。
[0024](I)种子培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂1%，酵母蛋白胨1%，硫酸铵1%，磷酸二氢钾0.15%，硝酸钠0.2%，七水硫酸镁0.05% ;ρΗ值为7.5 ；
配制获得种子培养基。
[0025](2)发酵培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂3%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾0.2%，硝酸钠0.1%，七水硫酸镁0.01% ；ρΗ值为8 ;配制获得发酵培养基。
[0026](3)制备灵菌红素:在种子培养基中，将粘质沙雷氏菌(Serraiia marcescens)扩大培养至活细胞含量为2X 106cfu/ml的菌液；将菌液按5%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液。发酵条件为:发酵温度30°C，搅拌转速300rpm，通气量1.0 V/V.min，罐压75 KPa，发酵时间40小时。
[0027]采用本实施例提供的制备方法，木本植物油脂的利用率为35%，灵菌红素的产量为22 g/L。
[0028]实施例4:
木本植物油脂的制备:取乌桕的成熟种子，干燥至水分含量为10%，机械粉碎至10目；然后进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为110°C，榨油机温度为90°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油经水化脱胶、中和酸性，除臭，除色工艺，获得乌桕油脂。乌桕油脂的主要成分为含油酸、亚油酸、亚麻酸的甘油酯，含有少量2，4-癸二烯酸和棕榈酸，外观白色、微黄、不透明，杂质为0.03%，游离脂肪酸3%，相对密度(25/25°C)为0.937，折射率(25°C )为1.482，酸价3mgKOH/g，碘值 175，皂化值 210 mgKOH/g。
[0029](I)种子培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂1%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵1%，磷酸二氢钾0.1%，硝酸钠0.1%，七水硫酸镁0.01%，pH值为7.5 ；配制获得种子培养基。
[0030](2)发酵培养基的配制:以蒸馏水为溶剂，配料及其质量比为:木本植物油脂9%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾0.1%，硝酸钠0.1%，七水硫酸镁0.01% ;pH值为7.5 ；配制获得发酵培养基。
[0031](3)制备灵菌红素:在种子培养基中，将粘质沙雷氏菌(5fer_raiia marcescens、贫大培养至活细胞含量为2X 106cfu/ml的菌液；将菌液按8%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液。发酵条件为:发酵温度32°C，搅拌转速200rpm，通气量0.5V/V.min,罐压70KPa,发酵时间30小时。
[0032] 采用本实施例提供的制备方法，木本植物油脂的利用率为30%，灵菌红素的产量为15g/L。[0033]实施例5:
木本植物油脂的制备:取山茶的成熟种子，干燥至水分含量为10%，机械粉碎至18目；然后进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为115°C，榨油机温度为80°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油经水化脱胶、中和酸性，除臭，除色工艺，获得山茶籽油脂。山茶籽油脂中油酸和亚油酸的总含量为85%，主要由棕榈酸和硬脂酸组成的饱和脂肪酸含量为10%，颜色浅黄，澄清透明，
气味清香。
[0034](1)种子培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂2%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾0.15%，硝酸钠0.2%，七水硫酸镁0.01% ；pH值为9 ；配制获得种子培养基。
[0035](2)发酵培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂15%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾0.2%，硝酸钠0.2%，七水硫酸镁0.01%, pH值为7.5 ；配制获得发酵培养基。
[0036](3)制备灵菌红素:在种子培养基中，将粘质沙雷氏菌(Sferraiia marcescens)扩大培养至活细胞含量为lX106cfu/ml的菌液；将菌液按2%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液。发酵条件为:发酵温度30°C，搅拌转速300rpm，通气量0.7V/V*min，罐压75 KPa，发酵时间32小时。
[0037]采用本实施例提供的制备方法，木本植物油脂的利用率为45%，灵菌红素的产量为28g/L。
[0038]实施例6:
木本植物油脂的制备步骤:取文冠果的成熟种子，干燥至水分含量为10%，机械粉碎至20目；然后进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为110°C，榨油机温度为80°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油经水化脱胶、中和酸性，除臭，除色工艺，获得文冠果油脂。文冠果油脂的硬脂酸和油酸总含量为38.9%，亚油酸含量为40.2%，黄色而透明，本发明采用的文冠果是我国特有的经济木本油料树种，种子含油率为30.4-47%，种仁含油量66.39%。
[0039](I)种子培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂1%，酵母蛋白胨1%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾0.15%，硝酸钠0.15%，七水硫酸镁0.03%, pH值为7.5 ;配制获得种子培养基。
[0040](2)发酵培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂11%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵1%，磷酸二氢钾0.2%，硝酸钠0.2%，七水硫酸镁0.04%, pH值为9 ;配制获得发酵培养基。
[0041](3)制备灵菌红素:在种子培养基中，将粘质沙雷氏菌(5fer_raiia marcescens、贫大培养至活细胞含量为1.5X106cfu/ml的菌液；将菌液按2%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液。发酵条件为:发酵温度32°C，搅拌转速280rpm，通气量0.5 V/V.min，罐压70 KPa，发酵时间30小时。
[0042]采用本实施例提供的制备方法，木本植物油脂的利用率为39%，灵菌红素的产量为15g/L。
[0043]实施例7:
木本植物油脂的制备:取麻疯树的成熟种子，干燥至水分含量为10%，机械粉碎至10目；然后进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为120°c，榨油机温度为90°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油经水化脱胶、中和酸性，除臭，除色工艺，获得麻疯树籽油脂。麻疯树籽油脂富含75%的油酸和亚油酸；油脂碘值低，半干性油，麻疯树籽的含油率为40%-60%。
[0044](I)种子培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂1%，酵母蛋白胨3%，硫酸铵2%，磷酸二氢钾0.15%，硝酸钠0.2%，七水硫酸镁0.02%, pH值为8 ；配制获得种子培养基。
[0045](2)发酵培养基的配制:以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂15%，酵母蛋白胨2%，硫酸铵2%，磷酸二氢钾0.1%，硝酸钠0.1%，七水硫酸镁0.01%, pH值为9 ;配制获得发酵培养基。
[0046](3)制备灵菌红素:在种子培养基中，将粘质沙雷氏菌(Sferraiia marcescens)扩大培养至活细胞含量为1.5X106cfu/ml的菌液；将菌液按8%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液。发酵条件为:发酵温度28°C，搅拌转速200rpm，通气量0.5V/V.min，罐压72KPa，发酵时间40小时。
[0047]采用本实 施例提供的制备方法，木本植物油脂的利用率为50%，灵菌红素的产量为29g/L。
【权利要求】
1.一种生产灵菌红素的发酵液的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)种子培养基配制 以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂1-2%、酵母蛋白胨1_3%、硫酸铵。1-3%、磷酸二氢钾0.1-0.15%、硝酸钠0.1-0.2%、七水硫酸镁0.01-0.05% ;pH值为7.5-9 ;配制获得种子培养基； (2)发酵培养基配制 以蒸馏水为溶剂；配料及其质量比为:木本植物油脂3-15%、酵母蛋白胨1-3%、硫酸铵。1-3%、磷酸二氢钾0.1-0.2%、硝酸钠0.1-0.2%、七水硫酸镁0.01-0.05% ;pH值为7.5-9 ;配制获得发酵培养基； (3)制备灵菌红素 在所述种子培养基中，将粘质沙雷氏菌扩大培养至活细胞含量为IXlO6 -2X IO6Cfu/ml的菌液；再将菌液按质量比为2-8%的量接种于装有所述发酵培养基的发酵罐中，进行发酵，获得灵菌红素发酵液；其中，发酵条件具体为:发酵温度28-32°C，搅拌转速200-300rpm,通气量0.5-1.0 V/V.min,罐压70-75 KPa,发酵时间30-40小时；所述灵菌红素发酵液中灵菌红素的含量为15-30g/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基配制步骤之前还包括: 木本植物油脂的制备:取木本植物的成熟种子，将所述成熟种子干燥至水分含量为。5-10%，再机械粉碎至10-20目；然后对粉碎后的成熟种子进行轧胚蒸炒，当蒸炒温度为。110-120°C，榨油机温度为80-90°C时，进行压榨，获得毛油；将毛油依次经水化脱胶、中和酸性、除臭以及除色后，获得木本植物油脂，所述木本植物油脂中所含的脂肪酸主要包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，其中以十六碳和十八碳的脂肪酸为主，不饱和脂肪酸含量高达90%以上，木本植物油脂富含单不饱和脂肪酸和亚麻酸，在高温时化学结构仍能保持稳定。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述木本植物为黄连木、光皮树、油桐、乌桕、山茶、文冠果或麻疯树中的一种。
【文档编号】C12R1/43GK103923958SQ201410187497
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】杨培周, 姜绍通, 程晓蕾, 张丹峰, 郑志, 罗水忠, 潘丽军, 苏文娟 申请人:合肥工业大学