专利名称：：一种用ACCα基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法
技术领域：
：本发明属于动物分子遗传学领域，特别涉及一种采用分子标记检测鸡腹脂量的方法。(二)
背景技术：
：肉鸡经过各国育种者多年的选育，其生产性能有了显著提高。在肉鸡早期生长速度得以明显提高的同时，肉鸡自身生理适应能力等方面也出现了一系列亟待解决的问题。快大型肉鸡体脂(尤其是腹脂)蓄积过多已成为一个特别突出的问题。肉仔鸡体内沉积过多的脂肪有诸多不利(1)明显降低饲料转化效率，因为沉积单位重量的脂肪组织比沉积单位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴体瘦肉对脂肪组织的比例，因而降低了分割肉产量；(3)加工者和消费者将肉仔鸡体内沉积的这些脂肪的很大一部分(腹脂垫、肌胃周围脂肪、嗉囔脂肪及肠系膜脂肪等)丢弃，这不仅增加了加工者和消费者的负担，而且增加了废物及处理水中的脂肪含量，从而污染环境。由此看来，肉仔鸡体内沉积过多的脂肪将会给生产者、加工者和消费者造成显而易见的经济损失。同时肉种鸡过肥也将会严重影响产蛋率、受精率和孵化率，并且会诱导脂肪肝综合症的发生，从而加大了产蛋期的死淘率。因此，控制脂肪在鸡体内的过多蓄积，进一步提高肉鸡的饲料转化效率和胴体质量是我国急需研究解决的重大问题。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACC)属于分子间羧化转移家族成员。乙酰辅酶A羧化酶有两种同型物乙酰辅酶A羧化酶a(ACCcc)和乙酰辅酶A羧化酶P(ACC(3)。ACC可以催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A，是脂肪合成的限速调节酶。丙二酸单酰辅酶A作为长链脂肪酸合成的前体,在脂肪酸的合成中作为2碳单位的供体，并目.在脂肪酸的氧化中作为线粒体穿梭系统的调节因子，同时还可以作为一种信号分子通过调节下丘脑来对摄食和能量平衡进行调控。在哺乳动物中，对两种类型的ACC基因的功能已经有了较为深入地研究。ACCcx与ACC(3分别位于胞质和线粒体膜上，由他们催化产生的丙二酸单酰辅酶A位于两个相对独立的区域，不会混合。位于胞质中的丙二酸单酰辅酶A用于进行脂肪酸的从头合成，而位于线粒体附近的丙二酸单酰辅酶A则调节肉毒碱棕榈酰转移酶I的活性，从而调控对脂肪酸的氧化(Abu-Elheiga，2005)。因此，脂肪酸的合成与氧化过程不是同时发生的。在鸟类和哺乳动物的脂肪合成组织中，ACCcx基因的转录水平受营养和激素双重调节。处于饥饿状态的鸡其肝脏中ACCa的转录水平是很低的，而当饲喂高碳水化合物、低脂肪的饲料时ACCa基因的转录水平能够提高11倍(Hillgartner等，1996)。体外培养原代鸡胚肝细胞时，加入激活型T3(三碘甲腺原氨酸)，能够使ACCot基因的转录效率提高5-7倍(Zhang等，2001)。Mooney等(2008)在研究山羊豆碱为什么会导致小鼠体重减少时发现，其主要途径为山羊豆碱能抑制ACC的活性，ACCot与ACC(3的活性降低能使脂肪合成减少，同时脂肪酸氧化加快，从而影响小鼠的体重性状。Liang等人(2006)的研究表明，ACCoc在脂肪代谢中具有重要的作用，ACQx功能异常可以导致肥胖、II型糖尿病等疾病，将ACCct作为药物的靶基因治疗肥胖等相关疾病有着重要意义。Abu-Elheiga等(2005)指出敲除大鼠ACCa基因后，大鼠产生胚胎致死现象，可以看出ACC(x对胚胎的早期发育非常重要。Takai等人(1987)在鸡的肝脏组织中分离出ACCa。ACCcc基因位于鸡19号染色体，CDS全长6974bp，DNA序列由50个外显子和49个内含子组成，全长92409bp，编码2324个氨基酸。鸡、小鼠、人的ACCa的氨基酸序列非常相似,其同源性约为90y。。在哺乳动物中，ACCa基因主要在肝脏和脂肪组织中表达。本课题组的研究表明ACCa基因在鸡腹脂、肝脏、脾脏、腺胃、肌胃中均有表达。
发明内容本发明的目的在于提供一种分子生物学技术，即采用PCR-RFLP的方法检测鸡ACCa基因外显子19中G—A变异位点，操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测的一种用ACCa基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法。本发明的目的是这样实现的1、根据鸡ACCot基因序列设计一对引物G2292AF和G2292AR,其中下游引物3'端最后一个碱基G为人为设计碱基(不与基因组序列配对)，目的是为了在突变碱基附近产生一个强制性酶切位点G2292AF:5'-TAGGTGGATGGTTGGGCTTGA-3'G2292AR:5'-CCCCATCCTCCACCACATG-3，2、禾U用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增片段长度为186bp;3、利用限制性内切酶MwoI消化扩增的PCR产物；4、使用质量比14。/。的聚丙烯酰胺凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，检测出ACCcx基因外显子19屮的G—A单碱基突变；—5、当鸡ACCa基因外显子19中变异位点为碱基G时，会产生限制性内切酶MwoI的酶切位点(GCTTATC/CAGC)，MwoI消化PCR产物后会产生2个片段(165bp、21bp)，将其命名为GG基因型；该位点为碱基A时(GCTTATCCAAC)，则不存在MwoI酶切位点，MwoI消化PCR产物后产牛1个片段(186bp)，将其命名为AA基因型；该位点为G/A杂合时，MwoI消化PCR产物后会产生3个片段(186bp、165bp、21bp)，将其命名为AG基因型(其中酶切后产生的21bp片段跑出凝胶，胶图中未显示该片段，利用186bp、165bp两条片段对该突变位点分型不影响结果)。本发明还包括这样一些技术特征1、所述的分析基因多态性的方法是通过检测碱基的突变而分类的基因型。2、所述的用丁-分析基因多态性的部位是外显子。3、所述的用于分析基因多态性的部位是由G2292AF和G2292AR表示的引物扩增的外显子区。4、所述的用于分析多态性的位点选自鸡ACQx基因如下序列中第464位的G—A的碱基突变。5、所述的鸡腹脂量指的是鸡的腹脂重和腹脂率。6、所述的用于消化PCR产物的限制性内切酶是MwoI。7、所述的PCR-RFLP分析中的聚丙烯酰胺凝胶质量比浓度为14%。本发明设计了一对强制性酶切位点的引物，采用PCR-RFLP的方法检测鸡ACCa基因外显子19中G—A变异位点，操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测。本发明根据鸡ACCa基因序列设计一对引物；利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增，并利用限制性内切酶MwoI消化扩增的PCR产物，然后使用14%的聚丙烯酰胺凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，检测出ACCa基因外显子19屮一个G—A的单碱基变异位点；分别对鸡ACQx基因该位点两种纯合型及杂合型进行命名。7周龄实验结果表明具有AA基因型个体的腹脂重和腹脂率分别比GG基因型个体腹脂重和腹脂率高6.03克和0.25%。利用本发明的分子标记方法对鸡腹脂性状进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时也为鸡的腹脂性状改良提供了一种有效的分了标记育种手段，从而可以加速低脂肉鸡的育种进程。实验证明具有AA基因型个体的腹脂重和腹脂率极显著高于具有GG基因型鸡的腹脂重和腹脂率(PO.Ol)。在本发明所研究的群体中，具有AA基因型个休的腹脂重比GG基因型个体的腹脂重高6.03克；具有AA基因型个体的腹脂率比GG基因型个体的腹脂率高0.25%。(四)图1是ACQx基因G2292A酶切位点分析图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述一、实验材料1.实验动物和性状测定东北农业大学高、低脂系第八世代、第九世代、第十世代、第十一IU;代资源群体，分别选取了374、362、624和477只鸡；7周龄时翅静脉采血，草酸盐抗凝；称量活重之后屠宰，称量屠体重、腹脂重等性状。2.药品和酶三羟甲基氨基甲垸(Tris)，SigmaChemicaLsCo;Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶K(ProteinaseK)，MMERCKCo;DL2000、dNTP(dATP;dTTP;dCTP;dGTP)、Taq酶，大连宝生物公司；琼脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，原平皓公司。3.主要仪器PTC-200PCR仪(PERKINELMER)、Biometra梯度PCR仪、UVP多功能成像系统、ULtrospec1000紫外分光光度计、BECKMAN冷冻离心机、MiLLi-Q超纯水仪、DYY—IH2稳压电泳仪及配套电泳槽。二、实验方法1.缓冲液与常用试剂的配制lMTris'Cl:121.14gTris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。TE缓冲液10mMTris'Cl,lmMEDTA,pH8.0,高压灭菌。20xSET缓冲液3MNaCl，1MTris'Cl(pH8.0),20mMEDTA(pH8.0),高压灭菌。5xTBE缓冲液54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5MEDTA(pH8.0)，加水至1L。50x丁AE缓冲液242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5MEDTA(pH8.0),加水至1L。lMTris'Cl:12U4gTris碱溶于800n]l双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。0.5MEDTA:186.1gEDTA溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。3MNaAc(pH5.2):408.1gNaAc'3H20溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至7.0，定容至1000ml。200ml银染液:NH3-H202ml;3.6%NaOH4.2ml;20%AgN033.6ml,加去离了水至200ml。200ml显色液1%柠檬酸钠lml;甲醛100ul;加去离于水至200ml。禽血裂解液10mMTris'Cl(pH8.0)，0.1MEDTA(pH8.0)，0.5%SDS。2.引物的设计与合成以下引物由上海博亚生物公司合成G2292AF:5'-TAGGTGGATGGTTGGGCTTGA陽3'G2292AR:5，-CCCCATCCTCCACCACATG-3'3.鸡基因组DNA的小量提取方法一(1)取20^1抗凝血液，加入500W禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200"ig/ml，混匀55'C消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。(2)将溶液冷却至室温，加入5MNaCl至终浓度1.5M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀lOmin。(3)12，000rpm，室温离心10min。取上清，加等休积氯仿混匀10min。(4)12，000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。(5)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70%乙醇洗1次。(6)7,500rpm,室温离心5min，弃上清。(7)将DNAT燥后(注意不能太干)溶于200WTE中。方法二(1)将全血加入装有700WlxSET的1.5ml离心管中，轻轻混匀。(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100-200吗1和10%的SDS至终浓度0.5%，55°C消化12h。(3)待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24:23:1)，混合10min。12，000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23:1)，来回颠倒混合10min，12，000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。(7)向水相中加入1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，来冋颠倒，沉淀DNA。(8)将DNA挑ll',放到1.5ml离心管中，用70%乙醇洗1次。(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。(10)加入200pl的TE，置5(TC水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20"C备用。4.PCR反应(1)以鸡DNA为模板进行PCR扩增，10uL反应体系中包含以下溶液或试剂1OxPCRreactionbuffer1|_iLdNTPMixture(各2.5mM)0.8(iL引物l(lOpM)O.ljaL引物2(10nM)O.ljiLEX-Taq(5U/pL)0.1pL去离子水6.9jliL;基因组DNA(50ng/|_iL)l.Oj^L(2)将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。94。C变性7min;94。C30sec，56°C30sec，72。C30sec，33个循环;72。C延伸7min。(3)反应结束后，取PCR反应液GjiL)进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物，4"C保存。5.PCR-RFLP反应体系及条件酶切体系如下MwoI内切酶1OUZpL0.8pL10xBuffer:lpLPCRProduction0.8^加去离子水至10|iL将上述反应液混匀，于37'C水浴中消化4小时。6.聚丙烯酰胺凝胶分析以质量比浓度为14%、体积为25ml，厚度为O.lcm的胶为例。(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。(2)在100ml烧杯内加入30%丙烯酰胺11.7ml，5xTBE5ml，10%过硫酸铵0.175ml，TEMED8pl，去离子水8.1ml，混匀后迅速灌胶。(3)当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳了，室温聚和半小时，多余的丙烯酰胺4'C保存。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。(4)凝胶聚合好后，向电泳槽加入lxTBE，用注射器冲洗加样孔。(5)预电泳10min，同时准备点样。(6)取lOpl酶消化产物置于PCR管中，加5-6pl非变性上样Buffer混匀，用微量注射器点样。(7)180伏，电泳3-4h。7.硝酸银染色方法(1)电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70%乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10-15min。(乙醇用完可以回收)。(2)双蒸水洗胶2遍，每次2min，去除残留乙醇。(3)用200ml染色液染色30min。(4)双蒸水洗胶3遍，每次2min。(5)用200ml显色液显色，约10-30min，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液。(6)去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存。8.统计模型建立根据资源群体的特点构建合适统讣模型①Y，+G+L+GE+G*L+G*GE+F(L)+D(F,L)+BW7+eY为性状观察值，p为群体均值，G为基因型固定效应，L为品系固定效应，GE为世代效应，G*L为基因型与品系的互作效应，G*GE基因型与世代的互作效应，F(L)为品系内家系的随机效应，D(F,L)为家系与品系内母鸡的随机效应，BW7作为协方差变量，e为剩余值。使用统计软件JMP4.0(SASInstituteInc.,Cary，NC)检验基因型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。三、实验结论J鸡ACQx基因的多态性与肉鸡高、低脂双向选择品系第八、九、卜、十一共四个世代的合并世代(以下简称"合并世代")腹脂性状的相关结合图1，利用本发明的引物(G2292AF和G2292AF)对肉鸡高、低脂双向选择品系鸡只的基因组DNA进行PCR扩增，并利用MwoI限制性内切酶消化PCR产物，然后进行体积比14%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。共检测到3种基因型，当鸡ACOx基因外显子19中变异位点为碱基G时，会产生限制性内切酶MwoI的酶切位点(GCTTATC/CAGC)，MwoI消化PCR产物后会产生2个片段(165bp、21bp)，将其命名为GG基因型；该位点为碱基A吋(GCTTATCCAAC)，则不存在MwoI酶切位点，MwoI消化PCR产物后产生1个片段(186bp)，将其命名为AA基因型；该位点为G/A杂合时，MwoI消化PCR产物后会产生3个片段(186bp、165bp、21bp)，将其命名为AG基因型(其中酶切后产生的21bp片段跑出凝胶，胶图中未显示该片段，利用186bp、165bp两条片段对该突变位点分型不影响结果)。对ACCcx基因G2292A位点产生的3种基因型与合并世代1837个个体的腹脂重和腹脂率进行最小二乘分析，结果表明基因型对鸡的腹脂重、腹脂率有极显著影响(P<0.01)(表1)。表1合并世代腹脂性状的最小-二乘分析结果(P值)腹脂重腹脂率基因型O.0001<0細1品系O.0001<0扁1世代O細l<0細1基因型与品系互作O.0001<0扁1基因型与世代互作O細l0扁1家系l細O1.0000母鸡0.99860.9957体重(协变量)<0細1<0細1对3种基R型间合并世代鸡只腹脂性状的最小二乘均值进行多重比较，结果表明AA基因型个体的腹脂重和腹脂率极显著高于AG型和GG型个体的腹脂重和腹脂率(PO.01);AA基因型个体的腹脂重和腹脂率比AG基因型个体的腹脂重和腹脂率分别高3.88克和0.14%;AA基因型个体的腹脂重和腹脂率比GG基因型个体的腹脂重和腹脂率分别高6.03克禾口0.25%(表2)。表2ACCa基因不同基因型对合并世代鸡只腹脂性状的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>均值比较时同--列无相同字母者差异极显著(A-Bp<0.01)a:加性效应，a=(GG-AA)/2d:显性效应，d=AG-(AA+GG)/2D:显性度D=d/a权利要求1、一种用ACCα基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征在于(1)根据鸡ACCα基因序列设计一对引物，其中下游引物3’端最后一个碱基G为人为设计碱基，不与基因组序列配对G2292AF5’-TAGGTGGATGGTTGGGCTTGA-3’G2292AR5’-CCCCATCCTCCACCACATG-3’；(2)利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增；(3)利用限制性内切酶消化扩增的PCR产物；(4)使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出ACCα基因外显子19中1个G→A的单碱基突异位点；(5)当鸡ACCα基因外显子19中多态性位点为碱基G时，会产生限制性内切酶MwoI的酶切位点GCTTATC/CAGC，MwoI消化PCR产物后会产生2个片段165bp、21bp，将其命名为GG基因型；该位点为碱基A时GCTTATCCAAC，则不存在MwoI酶切位点，MwoI消化PCR产物后产生1个片段186bp，将其命名为AA基因型；该位点为G/A杂合时，MwoI消化PCR产物后会产生3个片段186bp、165bp、21bp，将其命名为AG基因型。2、根据权利要求1所述的一种用ACCa基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是所述的分析基因多态性的方法是通过检测单碱基的突变而确定基因型。3、根据权利要求2所述的预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是所述的PCR扩增片段长度为186bp。4、根据权利要求3所述的一种用ACCct基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是所述的用于分析基因多态性的部位是由G2292AF和G2292AR表示的引物扩增的外显子区。5、根据权利要求4所述的一种用ACCa基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是所述的用于分析多态性的位点选自鸡ACCa基因如下序列中第464位的G—A的碱基突变6、根据权利要求l-5所述的一种用ACCa基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是其中鸡腹脂量是鸡的腹脂重和腹脂率。7、根据权利要求1-5所述的一种用ACOx基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是其中用于消化PCR产物的限制性内切酶是MwoI。8、根据权利要求l-5所述的一种用ACCa基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是其中用于PCR-RFLP分析的聚丙烯酰胺凝胶质量比浓度为14%。9、根据权利要求6所述的一种用ACC(x基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是其中用于PCR-RFLP分析的聚丙烯酰胺凝胶质量比浓度为14%。全文摘要本发明提供了一种用ACCα基因预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法。根据鸡ACCα基因序列设计一对引物；利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增，并利用限制性内切酶MwoI消化扩增的PCR产物。7周龄实验结果表明具有AA基因型个体的腹脂重和腹脂率分别比GG基因型个体腹脂重和腹脂率高6.03克和0.25％。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测。利用本发明的分子标记方法对鸡腹脂性状进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时也为鸡的腹脂性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，从而可以加速低脂肉鸡的育种进程。文档编号C12Q1/68GK101603086SQ20091007157公开日2009年12月16日申请日期2009年3月18日优先权日2009年3月18日发明者辉李,田建伟申请人:东北农业大学